蘇氨酸磷酸裂合酶電化學(xué)納米免疫傳感器的研究.pdf

1、本研究結(jié)合電化學(xué)分析可不受樣品的濁度、顏色的影響,所需設(shè)備儀器相對(duì)簡單的特點(diǎn)以及酶促反應(yīng)的高效性、免疫分析無需對(duì)樣品進(jìn)行純化、富集等預(yù)處理的特點(diǎn),以玻碳電極為基體電極,采用共價(jià)鍵合、靜電吸附和自組裝單分子層等生物分子固定技術(shù),并借助納米金的吸附能力強(qiáng)、比表面積大、良好的生物相容性和隧道效應(yīng)等特性以及殼聚糖良好的成膜性、機(jī)械性能、生物相容性等特性構(gòu)建了性能良好的蘇氨酸磷酸裂合酶(phosphothreonine lyase, SpvC)電

2、化學(xué)納米金免疫傳感器應(yīng)用于食品安全檢測(cè)分析中。
　　借助于生物分子相互作用儀(Octet? biolayer interferometry)從五株抗SpvC單克隆抗體(以沙門氏菌為抗原制備)中篩選出與SpvC純化蛋白親和力最強(qiáng)的單克隆抗體株,其解離平衡常數(shù)KD分別為:3.85E-10M、1.65E-09M、5.88E-10M、2.01E-09M、1.13E-09M,KD最小3.85E-10M即為親和力最強(qiáng)的單克隆抗體株,其結(jié)合常數(shù)

3、Kon和解離速度常數(shù)Kdis分別為3.73.E+03L/mol s-1,9.62E-07 s-1。
　　采用以納米金-硫堇-殼聚糖吸附辣根過氧化物酶為生物傳感的放大系統(tǒng),方法如下:將玻碳電極預(yù)處理后,取5μL0.5％殼聚糖溶液滴于電極表面,自然晾干制備的納米金溶膠中24h,然后將該電極置于互作儀所篩選的抗SpvC單克隆抗體中4℃自組裝24h,即得單層納米金修飾的傳感器。再取5μL制備的硫堇/殼聚糖共聚物溶液滴加于上述電極表面的中心

4、,自然干燥后將該電極置于納米金/辣根過氧化物酶溶液中4℃自組裝24h,再將該電極置于抗SpvC單克隆抗體中4℃自組裝24h,最后將該修飾電極置于BSA溶液(1g/100mL)中37℃溫育1h,以封閉非特異性位點(diǎn),以含0.05%(v/v) Tween-20的PBST溶液清洗未結(jié)合的牛血清白蛋白,自然晾干即得雙層納米金修飾的SpvC電化學(xué)免疫傳感器,置于4℃PBS緩沖環(huán)境中保存待用。
　　通過納米金溶膠吸附抗SpvC Balb/c小鼠

5、單克隆抗體,利用紫外光譜掃描、透射電鏡表征納米金,原子力顯微鏡、循環(huán)伏安及交流阻抗法表征其吸附和組裝的各階段,研制出電化學(xué)型納米金雙膜免疫傳感電極。利用電流時(shí)間曲線法分別測(cè)定 PBS稀釋的沙門氏菌和志賀氏菌懸液,結(jié)果表明響應(yīng)電流與兩種菌在10-1.0×104 cfu/mL范圍內(nèi)線性相關(guān),最低檢測(cè)限為5cfu/mL,線性方程分別為:△I=0.2103C+0.0256(R2=0.9943),△I=0.2044C+0.0263(R2=0.99