功能性聚合物的定點(diǎn)修飾對(duì)增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究.pdf

1、蛋白質(zhì)作為生物體內(nèi)不可或缺的組成成分，不僅是專一高效的催化劑，而且可作為用于疾病的診斷和治療的活性藥物。雖然蛋白質(zhì)在生物學(xué)反應(yīng)，酶工程，分子生物學(xué)以及臨床治療中應(yīng)用廣泛，但由于蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和脆弱性往往在復(fù)雜的應(yīng)用環(huán)境中表現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性和生物學(xué)活性，使得蛋白質(zhì)的應(yīng)用受到了一定的限制。如何有效提高蛋白質(zhì)在復(fù)雜環(huán)境中的活性及穩(wěn)定性迫在眉睫，同時(shí)也是拓寬蛋白質(zhì)應(yīng)用范圍的關(guān)鍵問題所在。其中利用聚合物對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾從而提高蛋白質(zhì)的性能

2、得到越來越多科研工作者的關(guān)注。
　　為此，本論文利用可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合以及合成化學(xué)制備出一系列不同類型、不同鏈長(zhǎng)且末端帶有吡啶二硫酯基團(tuán)的功能性聚合物，與蛋白質(zhì)無機(jī)焦磷酸酶（PPase）上特定位點(diǎn)突變的半胱氨酸巰基進(jìn)行反應(yīng)制備得到聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，系統(tǒng)地研究了聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物在不同環(huán)境因子改變的條件下的生物活性及穩(wěn)定性，并進(jìn)一步探討了聚合物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物在生物催化反應(yīng)和生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。具體研究?jī)?nèi)容如下：<

3、br>　　首先，利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在PPase活性中心附近的148位賴氨酸殘基突變成半胱氨酸殘基，構(gòu)建了無機(jī)焦磷酸酶單點(diǎn)突變體 K148C，并與 RAFT聚合制備獲得的不同鏈長(zhǎng)的聚 N-異丙基丙烯酰胺（ PNIPAM）結(jié)合形成偶聯(lián)物PNIPAM-PPase。溫敏性聚合物PNIPAM的修飾使得PPase的溫度耐受閾值顯著提高，其最適反應(yīng)溫度由未修飾酶的45℃提升至60℃；同時(shí)，蛋白質(zhì)的高溫耐受能力和熱穩(wěn)定性也明顯改善，當(dāng)修飾的PNIPA

4、M分子量達(dá)到66000時(shí)，偶聯(lián)物在60℃C下孵育3小時(shí)，其活性保留有77％左右，是未修飾酶的6.8倍。研究結(jié)果顯示了偶聯(lián)物 PNIPAM-PPase在高溫條件下優(yōu)異的溫度耐受性和熱穩(wěn)定性，為蛋白質(zhì)在體外不利的高溫條件下保持較高的生物活性和穩(wěn)定性提供了新的研究策略。
　　然后，我們進(jìn)一步探討了偶聯(lián)物PNIPAM-PPase在生物酶催化反應(yīng)中的應(yīng)用。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是分子生物學(xué)和基因工程的關(guān)鍵技術(shù)，在生物工程與臨床診斷中至關(guān)重

5、要。但因該反應(yīng)副產(chǎn)物焦磷酸根（PPi）的積累會(huì)阻礙反應(yīng)向正方向的順暢進(jìn)行，使得反應(yīng)效率降低。而傳統(tǒng)分解PPi的方法無法適應(yīng)PCR長(zhǎng)時(shí)間的高溫反應(yīng)條件。因此，我們將制備的PNIPAM-PPase偶聯(lián)物引入到PCR反應(yīng)中，通過分解PCR反應(yīng)過程中生成的PPi，在不影響反應(yīng)特異性的情況下，使得PCR反應(yīng)效率提高了1.5倍，達(dá)到顯著促進(jìn)PCR的效果。不僅如此，偶聯(lián)物在PCR的高溫且長(zhǎng)時(shí)間循環(huán)的反應(yīng)環(huán)境中仍能保持很高的分解PPi的活性，當(dāng)循環(huán)次數(shù)

6、達(dá)到100次時(shí)，偶聯(lián)物能保留大約78%的活性。該策略為實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在不利的高溫環(huán)境下保持有效的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性提供了可行的途徑和有意義的探索。
　　最后，考慮到PNIPAM為外源性聚合物存在生物相容性的問題，在體內(nèi)應(yīng)用方面可能存在一定的限制，因此我們進(jìn)一步地探究聚糖的修飾對(duì)蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性的影響。通過相同的策略制備糖聚物-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物從而模擬糖蛋白。我們利用甲基丙烯酰氯與氨基葡萄糖的酰胺化反應(yīng)制備出一種乙酰氨基葡萄糖（GlcNA

7、c）的單體類似物甲基丙烯酰胺葡萄糖（MAG），并通過RAFT聚合制備了一系列不同分子量的糖聚物（PMAG）。利用定點(diǎn)突變技術(shù)獲得突變體N124C，制備出糖蛋白類似物（PMAG-PPase）。糖聚物的引入極大地提高了蛋白質(zhì)的活性，且表現(xiàn)為較小分子量的糖聚物顯示出較高的活性，當(dāng)修飾的分子量為8000的PMAG時(shí)，蛋白質(zhì)的活性提高至14.12±0.66 kat/kg。不僅如此，與天然糖蛋白效果類似，偶聯(lián)物在較強(qiáng)酸堿溶液，高鹽溶液以及蛋白酶等復(fù)

8、雜條件下同樣表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性；與此同時(shí)，得益于糖聚物獨(dú)特的C-C主鏈結(jié)構(gòu)，PMAG-PPase能夠有效避免天然糖蛋白所無法避免的糖苷酶的降解，顯示了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。而且，通過蛋白質(zhì)自身能夠有效分解PPi的特點(diǎn)，PMAG-PPase能夠有效水解焦磷酸鈣，從而在治療焦磷酸鈣沉積病（CPDD）：類痛風(fēng)這一疑難雜癥中具有巨大的潛力。這種糖蛋白類似物在生物檢測(cè)和臨床治療中顯示出極高的價(jià)值。
　　綜上所述，通過定點(diǎn)修飾的方式構(gòu)建了一系列不同類