葡萄1--氨基環(huán)丙烷--1--羧酸合酶基因的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、分類號：密級：學(xué)校代碼：10165學(xué)號：201111217遣掌師耗大學(xué)碩士學(xué)位論文@葡萄卜氨基環(huán)丙烷1羧酸合酶基因的克隆和表達(dá)分析作者姓名：學(xué)科、專業(yè)：研究方向：導(dǎo)師姓名：初雪鵬遺傳學(xué)植物發(fā)育與分子生物學(xué)侯和勝教授2014年03月遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要ACC合成酶(1一氨基環(huán)丙烷一l一羧酸合酶，ACS)是植物乙烯合成中的關(guān)鍵酶。本研究以歐洲葡萄為材料，以ACS基因為研究對象進(jìn)行了研究，結(jié)果如下：1對CTAB法、改良SDS法和Tri

2、zol法提取葡萄RNA進(jìn)行了比較。結(jié)果表明CTAB法和改良SDS法都能提取到葡萄RNA。前者提取到的RNA質(zhì)量好，無污染和降解；后者則產(chǎn)量高，但有蛋白質(zhì)和DNA的污染，并有些降解；Trizol法無法提取獲得葡萄RNA，可能是受試劑中胍鹽的影響。利用CTAB法從不同組織中提取葡萄RNA，反轉(zhuǎn)錄后克隆得到VvACS3、VvACS4和VvACS53個基因。對這3個基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明：這3個基因均具有AATlike保守結(jié)構(gòu)域

3、。且有多處能被磷酸化修飾的位點(diǎn)，說明了VvACS在翻譯后的修飾階段易被磷酸化，可能與ACS活性有關(guān)。將實驗室已克隆到的6個VvACS基因推導(dǎo)的氨基酸序列與番茄、擬南芥和玉米的ACS蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果顯示：這些VvACS具有不同程度的相似性和同源性。為進(jìn)一步定性研究VvACS基因提供參考。2對葡萄葉片進(jìn)行乙烯、脫落酸處理和傷害誘導(dǎo)后，利用實時定量PCR對VvACS5基因相對表達(dá)量進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)外源乙烯和脫落酸

4、都能先促進(jìn)后抑制VvACS5的表達(dá)；傷害處理對M跚的表達(dá)具有促進(jìn)作用。說明VvACS5能響應(yīng)這些脅迫處理。這一發(fā)現(xiàn)初步證明ACS參與植物對脅迫的調(diào)控。3為進(jìn)一步分析VvACS5基因的功能，構(gòu)建了VvACS5基因植物雙元表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥。本研究采用了浸花法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。通過PCR方法和抗生素篩選初步驗證，葡萄VvACS5基因成功的轉(zhuǎn)到擬南芥基因組中。目前獲得了7株VvACS5轉(zhuǎn)基因擬南芥純系植株。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株表現(xiàn)出葉片大