熒光假單胞桿菌2P24中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）脫氨酶基因（acdS）的克隆.pdf

1、許多植物促生細(xì)菌中含有1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨酶基因(acdS)。已有報(bào)道認(rèn)為含有acaS的細(xì)菌，在植物種子表面或根部定殖時(shí)可將種子或根部分泌的ACC分解為α-丁酮酸和氨，從而降低植物體內(nèi)的ACC水平。ACC的減少導(dǎo)致乙烯的減少，因此解除了乙烯對(duì)植物根生長(zhǎng)的抑制，最終表現(xiàn)為促進(jìn)了植物根的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。 本研究利用已構(gòu)建的熒光假單胞桿菌Pseudomonas fluorescens 2P24基因組文庫(kù)，通過(guò)設(shè)計(jì)同源性引物

2、和PCR篩選法克隆了2P24的acdS基因和部分相鄰的調(diào)節(jié)基因。AcdS氨基酸序列與P. fluorescens 17的相似性為98％，與Pseudomonas syringae pv. phaseolicola 1448A的相似性為89％，與Ralstonia solanacearum GMI1000的相似性為86％。通過(guò)設(shè)計(jì)引物，內(nèi)缺失突變?cè)摶颍玫酵蛔冏覲M108。又以質(zhì)粒pRK415G作為acdS的載體，轉(zhuǎn)入野生菌P. flu

3、orescens 2P24中，得到該突變體的互補(bǔ)菌株P(guān)M108T2。在以ACC(3mM)為唯一氮源的改造過(guò)的M9培養(yǎng)液中培養(yǎng)40小時(shí)后發(fā)現(xiàn)野生型2P24和PM108T2可以生長(zhǎng)，PM108G生長(zhǎng)受到顯著抑制，而添加了NH<,4>Cl(0.03M)的改造過(guò)的M9中，PM108生長(zhǎng)與野生型無(wú)明顯差異。在添加了ACC(5mM)的改造過(guò)的M9培養(yǎng)液中誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗(yàn)中，培養(yǎng)23小時(shí)后野生型2P24和互補(bǔ)菌株P(guān)M108T2檢測(cè)到較高的ACC脫氨酶酶活

4、，而幾乎測(cè)不到含有空載體的PM108的ACC脫氨酶活性。待測(cè)菌株的生長(zhǎng)曲線在測(cè)定時(shí)間內(nèi)相互之間無(wú)顯著差異。以上結(jié)果說(shuō)明acdS在生防菌株2P24中是功能性的ACC脫氨酶基因。在ACC脫氨酶酶活隨ACC誘導(dǎo)時(shí)間變化的試驗(yàn)中，2P24誘導(dǎo)6小時(shí)的時(shí)候，酶活達(dá)到最高，隨后下降。利用含有空載體的2P24、acdS基因突變體PM108以及互補(bǔ)菌PM108T2處理油菜種子，在所用的試驗(yàn)條件下，根長(zhǎng)數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析，在0.05水平上并無(wú)顯著差異。說(shuō)明a