葡萄查耳酮合酶基因克隆及表達(dá)分析.pdf

1、分類號：密級：學(xué)校代碼： 1 0 1 6 5學(xué) 號：2 0 1 2 1 1 0 0 1 0 8 9遣掌師耗火擎碩士學(xué)位論文⑨葡萄查耳酮合酶基因克隆及表達(dá)分析作者姓名：學(xué)科、專業(yè)：研究方向：導(dǎo)師姓名：2015 年0 5 月遼寧師范大學(xué)碩士學(xué)位論文摘 要類黃酮物質(zhì)的合成途徑中的關(guān)鍵酶為查耳酮合酶( c h a l c o n es y n t h a s e ，C H S ) ，它催化3 分子的丙二酰輔酶A ( m a l o n y lC

2、 o A ) 與1 分子的香豆酰C o A ( c o u m a r y l C o A ) 生成4 ，5 ，7 一三羥基黃烷酮( n a r i g e n i n c h a l c o n e ) 。葡萄果實(shí)中含有極其豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其中包括多酚類物質(zhì)，是一種大眾性水果，常用于鮮食、制成果汁、葡萄干和葡萄酒等。但葡萄的抗逆性較差，易受環(huán)境影響，導(dǎo)致其產(chǎn)量和質(zhì)量下降。為探討C H S 基因在葡萄植株防御體系中的作用，以及在次生代謝

3、物合成中的作用，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行如下研究：1 ．實(shí)驗(yàn)中，以N C B I 和T I G R 數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，采用R T ．P C R 技術(shù)，從葡萄中成功克隆得到兩個(gè)查耳酮合酶( C H S ) 的c D N A 開放閱讀框( O I 強(qiáng)) 序列V v C H S l 和V v C H S 3 。其中，V v C H S l 序列長l 1 8 2 b p ，編碼3 9 3 個(gè)氨基酸；V v C H S 3 序列長1 1 7 0 b p ，編碼3

4、8 9個(gè)氨基酸。2 ．在T I G R 基因索引數(shù)據(jù)庫中，以G r a p e 和c h a l c o n es y n t h a s e 為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，查詢出具有同源性的V v C H S 基因的所有E S T 序列。利用N C B I 的O R F F i n d e r 程序，對得到的序列進(jìn)行O R F 預(yù)測，結(jié)果顯示具有完整O R F 的序列共5 個(gè)，并利用軟件對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。分析內(nèi)容包括：各種氨基酸的組成( 種

5、類及數(shù)量) ，以及蛋白的一級結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)( 信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域等) 、疏水性、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)，啟動子中含有的順式作用元件和進(jìn)化分析等。3 ．葡萄葉片經(jīng)過紫外線( U V ) ‘輻射和水楊酸( S A ) 噴灑處理后，采用實(shí)時(shí)熒光定量P C R 技術(shù)，對V v C H S l 和V v C H S 3 的表達(dá)量的變化情況進(jìn)行分析。通過實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析處理，得出結(jié)論：在不同的處理?xiàng)l件下，二者的相對表達(dá)量均出現(xiàn)了具有一定的規(guī)律性的變化，結(jié)

6、果顯示為先上升后緩慢下降趨勢，且都在1 2 h 處表達(dá)量達(dá)到最高值。這表明V v C H S l 和V v C H S 3 基因通過調(diào)節(jié)表達(dá)量參與植物抗逆過程。本文對葡萄查耳酮合酶V v C H S l 和V v C H S 3 基因克隆，以及對其所編碼蛋白的理化性質(zhì)和進(jìn)化關(guān)系分析，為進(jìn)一步研究該基因的功能及其在葡萄適應(yīng)性機(jī)制中的調(diào)節(jié)作用以及代謝轉(zhuǎn)換奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：葡萄遺傳；查耳酮合酶；基因克?。簧镄畔W(xué)分析；實(shí)時(shí)熒光定量P C