乙肝病毒相關(guān)性腎炎腎小球足細(xì)胞病變機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分兒童HBV-MN腎組織細(xì)胞凋亡的研究目的觀察兒童乙型肝炎病毒相關(guān)性膜性腎?。╤epatitis B virus-associated membranous nephropathy, HBV-MN）腎組織的細(xì)胞凋亡情況，以探討其在HBV-MN發(fā)病中的意義。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)19例HBV-MN及5例正常腎組織caspase-3的表達(dá)，取細(xì)胞核呈棕黃色者為活性caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)數(shù)平均單個(gè)腎小球內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞比例及平均

2、單位面積內(nèi)腎小管-間質(zhì)區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)，分別計(jì)為腎小球凋亡指數(shù)和腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)，并分析其與腎組織病理改變、尿蛋白、及臨床免疫學(xué)指標(biāo)等因素的關(guān)系。同時(shí)對(duì)其中15例患兒行TUNEL檢測(cè)，取細(xì)胞核呈棕黃色者為TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，以前述方法計(jì)算腎小球及腎小管-間質(zhì)區(qū)的TUNEL指數(shù)，并分析其與凋亡指數(shù)（由活性caspase-3所得）的相關(guān)性。采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)14例HBV-MN及3例正常腎組織HBx的表達(dá)。結(jié)果①正常腎組織，casp

3、ase-3僅見(jiàn)于少數(shù)腎小管上皮細(xì)胞胞漿，未見(jiàn)腎小球內(nèi)表達(dá)；在HBV-MN患兒腎組織，均存在caspase-3的腎小球內(nèi)表達(dá)，并且大多見(jiàn)于足細(xì)胞胞核區(qū)，而在腎小管-間質(zhì)區(qū)caspase-3不僅見(jiàn)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿，尚可見(jiàn)于胞核區(qū)，且表達(dá)的細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組；以TUNEL分析對(duì)活性caspase-3染色進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)腎小球和腎小管-間質(zhì)區(qū)的凋亡指數(shù)與TUNEL指數(shù)均顯著相關(guān)（r=0.812, P=0.0496 & r=0.958, P=

4、0.0026）；②HBV-MN患兒腎組織活性caspase-3的表達(dá)與腎臟病變病理分期顯著相關(guān)，Ⅲ-Ⅳ期患兒的腎小球凋亡指數(shù)及腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)均明顯高于Ⅰ-Ⅱ期（P=0.015, 0.049）；但腎小球凋亡指數(shù)與HBsAg的沉積強(qiáng)度無(wú)顯著相關(guān)性；③HBV-MN患兒腎小球內(nèi)活性Caspase-3的表達(dá)與臨床蛋白尿水平相關(guān)，24h尿蛋白定量大于50mg/kg患兒的腎小球凋亡指數(shù)明顯高于小于50mg/kg者（P=0.034），但與血清補(bǔ)

5、體C3水平無(wú)顯著相關(guān)性；④HBV-MN患兒腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)與蛋白尿水平顯著相關(guān)，24h尿蛋白定量大于50mg/kg患兒的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于小于50mg/kg者（P=0.0046）；且與尿RBP水平相關(guān)，尿RBP升高組的活性caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著高于尿RBP正常組（P=0.0012）。⑤71％HBV-GN患兒的腎小球內(nèi)存在不同程度的HBx表達(dá)，其主要分布于腎小球毛細(xì)血管襻及足細(xì)胞胞漿。結(jié)論 HBV-MN患兒腎小球及腎小管-

6、間質(zhì)區(qū)均存在依賴caspase-3的腎臟固有細(xì)胞凋亡，活性caspase-3的表達(dá)與腎臟病變嚴(yán)重程度、臨床蛋白尿水平及尿RBP水平相關(guān)。腎臟固有細(xì)胞凋亡可能在HBV-MN的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而HBx蛋白可能與足細(xì)胞凋亡及進(jìn)而的缺失密切相關(guān)。
　　
　　 第二部分?jǐn)y帶HBx基因重組腺病毒載體制備及其對(duì)足細(xì)胞凋亡的影響目的臨床病理研究部分提示凋亡是HBV-MN患兒腎小球足細(xì)胞缺失的主要原因之一。而HBV-GN通常發(fā)生

7、于HBV慢性感染患者，在此病理過(guò)程中HBV-DNA可與宿主DNA隨機(jī)整合并發(fā)生基因重排，編碼HBx等反式激活因子，進(jìn)而誘導(dǎo)宿主細(xì)胞增殖或凋亡。因此，本部分研究旨在通過(guò)復(fù)制缺陷型腺病毒載體將HBx基因?qū)胱慵?xì)胞株，研究HBx對(duì)足細(xì)胞凋亡的直接效應(yīng)。方法由質(zhì)粒PCI-neo-HBx中擴(kuò)增目的基因HBx，插入至pShuttle-CMV(-)穿梭質(zhì)粒中，而后再與pAdxsi質(zhì)粒進(jìn)行酶切連接為重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HBx，經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定正確后，

8、以PacⅠ酶切線性化轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝擴(kuò)增得到Ad. HBx。以CsCl密度梯度離心法純化病毒，TCID50法檢測(cè)病毒滴度。以瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)。Annexin V-PI雙染方法檢測(cè)足細(xì)胞凋亡。結(jié)果①重組腺病毒載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、電泳和基因測(cè)序鑒定, 證實(shí)Ad. HBx構(gòu)建成功；②細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，腺病毒感染后24h，Ad. HBx組細(xì)胞的核分裂相明顯增多甚至出現(xiàn)病理性核分裂相，巨核、雙核、多核細(xì)胞的比例也較Ad組明

9、顯增加，但兩組間的細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異；腺病毒感染后48h，Ad. HBx組細(xì)胞除上述有絲分裂障礙的病變更加明顯外，胞體縮小、胞核濃染固縮的凋亡細(xì)胞比例較Ad組明顯增多；③ Annexin V-PI雙染法顯示，于腺病毒感染后24h，空白對(duì)照組、Ad組和Ad. HBx組三組間的凋亡細(xì)胞比例無(wú)明顯差異；而于感染后48h，Ad. HBx組細(xì)胞的凋亡率較空白對(duì)照組和Ad組均明顯升高（P<0.05）。結(jié)論成功構(gòu)建了Ad. HBx為進(jìn)一步研究HBx

10、基因在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ)。外源性HBx表達(dá)可直接誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。HBx可能是致HBV-GN患兒足細(xì)胞缺失的主要病因之一，在HBV-GN的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。
　　
　　 第三部分外源性HBx表達(dá)抑制小鼠足細(xì)胞增殖目的乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎（hepatitis B virus-associated nephritis, HBV-GN）是一種以足細(xì)胞病變?yōu)樘卣鞯募膊　BV-GN患兒腎活檢組織中

11、足細(xì)胞數(shù)目均存在不同程度減少，而增殖受限是足細(xì)胞缺失的主要機(jī)制之一。本研究通過(guò)構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒載體將HBV X基因（即HBx基因）導(dǎo)入足細(xì)胞株，探討HBx蛋白對(duì)足細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制。方法采用pAdxsi系統(tǒng)構(gòu)建攜帶HBx基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體；以瑞氏-吉姆薩染色觀察細(xì)胞形態(tài)；以MTT檢測(cè)和CFDA SE熒光染料示蹤細(xì)胞增殖的方法，對(duì)細(xì)胞增殖進(jìn)行定量評(píng)估；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布；采用cyclin/DNA雙參數(shù)流式細(xì)

12、胞術(shù)和Western-blot檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)。結(jié)果 PCR和基因測(cè)序鑒定，證實(shí)Ad. HBx構(gòu)建成功。Western blot顯示，足細(xì)胞感染Ad. HBx（MOI=100）后第3、5天均可表達(dá)分子量為17kD的HBx蛋白，表明HBx可在足細(xì)胞株穩(wěn)定表達(dá)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示腺病毒感染后第5天Ad. HBx組細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的有絲分裂障礙特征，雙核、多核和多形核細(xì)胞比例明顯增加。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示空白組和Ad組足細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線基本

13、吻合，而Ad. HBx組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線自第4天起較前兩組偏低，至第5天時(shí)該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)，CFSE細(xì)胞增殖示蹤實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，于腺病毒感染后第3天Ad. HBx組細(xì)胞的增殖速度（增殖指數(shù)11.15）已明顯低于空白組和Ad組（增殖指數(shù)15.4和13.3），且隨時(shí)間推移進(jìn)一步減慢（增殖指數(shù)32.5vs. 61.65，53.96），表明HBx可顯著抑制足細(xì)胞增殖。細(xì)胞周期分析和細(xì)胞周期調(diào)控蛋白檢測(cè)的結(jié)果顯示，HBx可誘導(dǎo)足細(xì)胞周期G2/