乙肝病毒相關(guān)性腎炎腎小球足細胞病變機制的研究.pdf

1、第一部分兒童HBV-MN腎組織細胞凋亡的研究目的觀察兒童乙型肝炎病毒相關(guān)性膜性腎病（hepatitis B virus-associated membranous nephropathy, HBV-MN）腎組織的細胞凋亡情況，以探討其在HBV-MN發(fā)病中的意義。方法采用免疫組織化學(xué)方法檢測19例HBV-MN及5例正常腎組織caspase-3的表達，取細胞核呈棕黃色者為活性caspase-3陽性細胞，計數(shù)平均單個腎小球內(nèi)陽性細胞比例及平均

2、單位面積內(nèi)腎小管-間質(zhì)區(qū)陽性細胞個數(shù)，分別計為腎小球凋亡指數(shù)和腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)，并分析其與腎組織病理改變、尿蛋白、及臨床免疫學(xué)指標(biāo)等因素的關(guān)系。同時對其中15例患兒行TUNEL檢測，取細胞核呈棕黃色者為TUNEL陽性細胞，以前述方法計算腎小球及腎小管-間質(zhì)區(qū)的TUNEL指數(shù)，并分析其與凋亡指數(shù)（由活性caspase-3所得）的相關(guān)性。采用免疫組織化學(xué)方法檢測14例HBV-MN及3例正常腎組織HBx的表達。結(jié)果①正常腎組織，casp

3、ase-3僅見于少數(shù)腎小管上皮細胞胞漿，未見腎小球內(nèi)表達；在HBV-MN患兒腎組織，均存在caspase-3的腎小球內(nèi)表達，并且大多見于足細胞胞核區(qū)，而在腎小管-間質(zhì)區(qū)caspase-3不僅見于腎小管上皮細胞胞漿，尚可見于胞核區(qū)，且表達的細胞數(shù)明顯多于對照組；以TUNEL分析對活性caspase-3染色進行驗證，發(fā)現(xiàn)腎小球和腎小管-間質(zhì)區(qū)的凋亡指數(shù)與TUNEL指數(shù)均顯著相關(guān)（r=0.812, P=0.0496 & r=0.958, P=

4、0.0026）；②HBV-MN患兒腎組織活性caspase-3的表達與腎臟病變病理分期顯著相關(guān)，Ⅲ-Ⅳ期患兒的腎小球凋亡指數(shù)及腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)均明顯高于Ⅰ-Ⅱ期（P=0.015, 0.049）；但腎小球凋亡指數(shù)與HBsAg的沉積強度無顯著相關(guān)性；③HBV-MN患兒腎小球內(nèi)活性Caspase-3的表達與臨床蛋白尿水平相關(guān)，24h尿蛋白定量大于50mg/kg患兒的腎小球凋亡指數(shù)明顯高于小于50mg/kg者（P=0.034），但與血清補

5、體C3水平無顯著相關(guān)性；④HBV-MN患兒腎小管-間質(zhì)區(qū)凋亡指數(shù)與蛋白尿水平顯著相關(guān)，24h尿蛋白定量大于50mg/kg患兒的陽性細胞數(shù)明顯高于小于50mg/kg者（P=0.0046）；且與尿RBP水平相關(guān)，尿RBP升高組的活性caspase-3陽性細胞數(shù)顯著高于尿RBP正常組（P=0.0012）。⑤71％HBV-GN患兒的腎小球內(nèi)存在不同程度的HBx表達，其主要分布于腎小球毛細血管襻及足細胞胞漿。結(jié)論 HBV-MN患兒腎小球及腎小管-

6、間質(zhì)區(qū)均存在依賴caspase-3的腎臟固有細胞凋亡，活性caspase-3的表達與腎臟病變嚴重程度、臨床蛋白尿水平及尿RBP水平相關(guān)。腎臟固有細胞凋亡可能在HBV-MN的病理過程中發(fā)揮重要作用，而HBx蛋白可能與足細胞凋亡及進而的缺失密切相關(guān)。
　　
　　 第二部分攜帶HBx基因重組腺病毒載體制備及其對足細胞凋亡的影響目的臨床病理研究部分提示凋亡是HBV-MN患兒腎小球足細胞缺失的主要原因之一。而HBV-GN通常發(fā)生

7、于HBV慢性感染患者，在此病理過程中HBV-DNA可與宿主DNA隨機整合并發(fā)生基因重排，編碼HBx等反式激活因子，進而誘導(dǎo)宿主細胞增殖或凋亡。因此，本部分研究旨在通過復(fù)制缺陷型腺病毒載體將HBx基因?qū)胱慵毎辏芯縃Bx對足細胞凋亡的直接效應(yīng)。方法由質(zhì)粒PCI-neo-HBx中擴增目的基因HBx，插入至pShuttle-CMV(-)穿梭質(zhì)粒中，而后再與pAdxsi質(zhì)粒進行酶切連接為重組腺病毒質(zhì)粒pAd-HBx，經(jīng)酶切及測序鑒定正確后，

8、以PacⅠ酶切線性化轉(zhuǎn)染293細胞進行包裝擴增得到Ad. HBx。以CsCl密度梯度離心法純化病毒，TCID50法檢測病毒滴度。以瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)。Annexin V-PI雙染方法檢測足細胞凋亡。結(jié)果①重組腺病毒載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、電泳和基因測序鑒定, 證實Ad. HBx構(gòu)建成功；②細胞形態(tài)學(xué)觀察顯示，腺病毒感染后24h，Ad. HBx組細胞的核分裂相明顯增多甚至出現(xiàn)病理性核分裂相，巨核、雙核、多核細胞的比例也較Ad組明

9、顯增加，但兩組間的細胞凋亡率無明顯差異；腺病毒感染后48h，Ad. HBx組細胞除上述有絲分裂障礙的病變更加明顯外，胞體縮小、胞核濃染固縮的凋亡細胞比例較Ad組明顯增多；③ Annexin V-PI雙染法顯示，于腺病毒感染后24h，空白對照組、Ad組和Ad. HBx組三組間的凋亡細胞比例無明顯差異；而于感染后48h，Ad. HBx組細胞的凋亡率較空白對照組和Ad組均明顯升高（P<0.05）。結(jié)論成功構(gòu)建了Ad. HBx為進一步研究HBx

10、基因在乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎發(fā)病中的作用奠定了基礎(chǔ)。外源性HBx表達可直接誘導(dǎo)足細胞凋亡。HBx可能是致HBV-GN患兒足細胞缺失的主要病因之一，在HBV-GN的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。
　　
　　 第三部分外源性HBx表達抑制小鼠足細胞增殖目的乙型肝炎病毒相關(guān)性腎炎（hepatitis B virus-associated nephritis, HBV-GN）是一種以足細胞病變?yōu)樘卣鞯募膊?。HBV-GN患兒腎活檢組織中

11、足細胞數(shù)目均存在不同程度減少，而增殖受限是足細胞缺失的主要機制之一。本研究通過構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒載體將HBV X基因（即HBx基因）導(dǎo)入足細胞株，探討HBx蛋白對足細胞增殖的影響及其分子機制。方法采用pAdxsi系統(tǒng)構(gòu)建攜帶HBx基因的復(fù)制缺陷型腺病毒載體；以瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)；以MTT檢測和CFDA SE熒光染料示蹤細胞增殖的方法，對細胞增殖進行定量評估；采用流式細胞儀檢測細胞周期分布；采用cyclin/DNA雙參數(shù)流式細

12、胞術(shù)和Western-blot檢測細胞周期調(diào)控蛋白的表達。結(jié)果 PCR和基因測序鑒定，證實Ad. HBx構(gòu)建成功。Western blot顯示，足細胞感染Ad. HBx（MOI=100）后第3、5天均可表達分子量為17kD的HBx蛋白，表明HBx可在足細胞株穩(wěn)定表達。細胞形態(tài)學(xué)觀察顯示腺病毒感染后第5天Ad. HBx組細胞呈現(xiàn)明顯的有絲分裂障礙特征，雙核、多核和多形核細胞比例明顯增加。MTT檢測結(jié)果顯示空白組和Ad組足細胞的生長曲線基本

13、吻合，而Ad. HBx組細胞的生長曲線自第4天起較前兩組偏低，至第5天時該差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；同時，CFSE細胞增殖示蹤實驗也證實，于腺病毒感染后第3天Ad. HBx組細胞的增殖速度（增殖指數(shù)11.15）已明顯低于空白組和Ad組（增殖指數(shù)15.4和13.3），且隨時間推移進一步減慢（增殖指數(shù)32.5vs. 61.65，53.96），表明HBx可顯著抑制足細胞增殖。細胞周期分析和細胞周期調(diào)控蛋白檢測的結(jié)果顯示，HBx可誘導(dǎo)足細胞周期G2/