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文檔簡(jiǎn)介
1、文昌魚(amphioxus或lancelet)隸屬脊索動(dòng)物門(Phylum Chordata)頭索動(dòng)物亞門(Subphylum Cephalochordata),在脊椎動(dòng)物的演化過(guò)程中扮演非常重要的角色。Pax4/6屬于Pax基因家族成員,該家族所編碼的蛋白是一類在后口動(dòng)物中均十分保守的轉(zhuǎn)錄因子。
本文對(duì)白氏文昌魚(Branchiostoma belcheri)Pax4/6基因進(jìn)行克隆,并確定該基因至少存在3種轉(zhuǎn)錄本(Bb
2、Pax4/6-AP1~3),其區(qū)別在于5' UTR以及N端的若干個(gè)氨基酸序列,形成的原因是選擇性啟動(dòng)子的使用。在研究3種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)模式之前,我們首先對(duì)BbPax4/6整體表達(dá)情況進(jìn)行研究,通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn)該基因從神經(jīng)胚早期才開始出現(xiàn)微弱表達(dá),在神經(jīng)胚中期達(dá)到最高之后其表達(dá)量逐漸下降。原位雜交結(jié)果顯示該基因的表達(dá)區(qū)域特異地出現(xiàn)于胚體最前端、神經(jīng)管前端位點(diǎn)以及口前窩(將來(lái)發(fā)育成哈氏窩,與脊椎動(dòng)物腺垂體同源),推測(cè)BbPax4/6可
3、能與嗅覺(jué)相關(guān)細(xì)胞、前眼(與脊椎動(dòng)物對(duì)眼同源)以及口前窩的發(fā)育相關(guān),并且這些功能在文昌魚與脊椎動(dòng)物中均十分保守。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,BbPax4/6的3種轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量與表達(dá)趨勢(shì)上存在差異,但是,整胚原位雜交的結(jié)果初步顯示,3種轉(zhuǎn)錄本均在胚體前端、神經(jīng)板(管)前端位點(diǎn)以及口前窩表達(dá),并沒(méi)有出現(xiàn)表達(dá)區(qū)域的分化。分析原因可能是3種轉(zhuǎn)錄本確實(shí)均在這幾個(gè)表達(dá)區(qū)域起作用,同一區(qū)域中,各自的表達(dá)量可能存在著差異,但是通過(guò)整胚原位
4、雜交無(wú)法體現(xiàn)這些差異。此外,頭索動(dòng)物文昌魚與脊椎動(dòng)物有所不同,脊椎動(dòng)物中許多復(fù)雜的器官(如兩側(cè)對(duì)稱的眼),在文昌魚內(nèi)也許只有若干個(gè)細(xì)胞與之同源(脊椎動(dòng)物對(duì)眼的同源結(jié)構(gòu)——文昌魚前眼僅由一個(gè)前端的色素眼點(diǎn)和與之相應(yīng)的感光細(xì)胞以及一些神經(jīng)細(xì)胞組成),不過(guò)這些細(xì)胞之間仍然有分化。同一基因在這些細(xì)胞作用時(shí),可能需要不同轉(zhuǎn)錄本來(lái)運(yùn)作,但這些轉(zhuǎn)錄本可能只存在細(xì)胞與細(xì)胞之間的微小差別,這些差別可能無(wú)法通過(guò)整胚原位雜交來(lái)體現(xiàn)。
我們針對(duì)B
5、bPax4/6設(shè)計(jì)了1條Morpholino(MO)與4條siRNA,利用顯微注射技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)BbPax4/6基因抑制的研究。其中MO設(shè)計(jì)位置為轉(zhuǎn)錄本BbPax4/6-AP2翻譯起始位點(diǎn)上游-46bp~-22bp區(qū)域。通過(guò)對(duì)胚胎正常發(fā)育率的統(tǒng)計(jì),我們發(fā)現(xiàn)注射過(guò)MO的實(shí)驗(yàn)組與注射過(guò)control MO的對(duì)照組之間并不存在顯著性差異,因此我們推測(cè)不同轉(zhuǎn)錄本之間可能存在代償機(jī)制,使PAX4/6蛋白水平并未受到影響。此外,在3種轉(zhuǎn)錄本共有的保守
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