白氏文昌魚Amphip38基因克隆及免疫功能的分析.pdf

1、絲裂酶原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)級聯(lián)反應(yīng)是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)之一。p38MAPKs是MAPK家族中的重要成員，被認(rèn)為是細(xì)胞眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的中轉(zhuǎn)站。MAPK的激活需要雙位點(diǎn)磷酸化，p38亞家族的所有成員都具有“T-G-Y”雙位點(diǎn)磷酸化模塊。通過上游的MKK3和MKK6磷酸化TGY模塊而激活p38蛋白。磷酸化的P38再激活一些轉(zhuǎn)錄因子和其他的蛋白酶后可導(dǎo)致許多生物

2、學(xué)效應(yīng)的發(fā)生，參與細(xì)胞存活、分化和凋亡等過程，在炎癥、應(yīng)激反應(yīng)中也有重要作用。文昌魚是脊索動物中的基底生物，是研究無脊椎動物過渡到脊椎動物的模式動物，文昌魚在生物進(jìn)化中的特殊地位，能夠?yàn)檠芯考棺祫游飌38MAPKs信號通路以及免疫系統(tǒng)的進(jìn)化提供關(guān)鍵的證據(jù)。本論文以白氏文昌魚p38為研究對象，通過基因克隆、實(shí)時定量PCR、免疫印跡、生物信息分析等技術(shù)手段得到以下的研究結(jié)果:
　　(1)本研究采用RACE技術(shù)克隆了白氏文昌魚p38基因

3、全長，命名為Arnphip38。其cDNA序列全長為1329bp，其中5'UTR為88bp，3'UTR為131bp，ORF長為1110bp。Amphip38的ORF編碼了369個氨基酸，包含一個高度保守的STK（絲氨酸/蘇氨酸激酶）結(jié)構(gòu)域。預(yù)測蛋白分子量為42 kDa，等電點(diǎn)為5.52。
　　(2)通過蛋白序列的同源性分析，Amphip38與其他物種的p38蛋白氨基酸序列有較高的相似性(80.5％-84％)和一致性(67.2％-7

4、2.5％)。Amphip38與脊椎動物鱸魚(Dicentrarchus labrax)的Mapk14有最高一致性為72.5％。由此可以確認(rèn)Amphip38是脊椎動物p38的同源基因。
　　(3)同源性分析可見p38蛋白在動物中較保守，通過p38蛋白一級結(jié)構(gòu)氨基酸序列的分析，在p38蛋白中STK結(jié)構(gòu)域是非常保守的。TGY模塊、CD模塊，ATP結(jié)合環(huán)(ATP binding loop)、 ED位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)(substratebi

5、nding site)，這些保守的位點(diǎn)對p38蛋白行使功能有重要的作用。我們進(jìn)一步預(yù)測了p38蛋白的三級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Amphip38與其他物種的p38蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，呈馬鞍形狀，蛋白表面有一個重要的凹槽，凹槽中有p38蛋白重要的結(jié)構(gòu)-“磷酸化唇”，TGY motif就在這個區(qū)域，是p38的激活位點(diǎn)。Docking site，CDsite，ED site在Amphip38蛋白空間結(jié)構(gòu)中都位于蛋白三維結(jié)構(gòu)表面，這可能與p38蛋白與底物的結(jié)合

6、有關(guān)。
　　(4)將白氏文昌魚Amphip38蛋白和其他物種p38蛋白進(jìn)行比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果表明:白氏文昌魚Amphip38基因的進(jìn)化地位位于無脊椎動物與脊椎動物之間，與脊椎動物更為親近。另外，p38家族在從無脊椎動物到脊椎動物進(jìn)化過程中可能發(fā)生了基因重復(fù)或分化，導(dǎo)致生成了四個亞型(p38α、p38β、p38γ和p38δ)。
　　(5)利用實(shí)時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，Amphip38在五個組織中都廣泛表達(dá)，但表達(dá)量有

7、差異:Amphip38在脊索與肌肉中表達(dá)量豐富，在肝盲囊表達(dá)量適中，在腸與鰓中較低。在脊索和肌肉中的高表達(dá)量可能與p38的組織特異性功能有關(guān)，在肌肉和脊索中可能主要參與細(xì)胞的增值、分化的調(diào)控，由于肝盲囊是脊椎動物肝臟的前體組織，在肝盲囊中較高的表達(dá)可能與文昌魚的免疫炎癥反應(yīng)有關(guān)。
　　(6)采用實(shí)時熒光定量PCR檢測LPS刺激后在不同時間點(diǎn)(2h，4h，6h，8h，12h，24 h)文昌魚Amphip38基因的表達(dá)量變化，在4h和

8、6h出現(xiàn)了顯著升高，并且在6h上升到最高。此變化初步證明了白氏文昌魚Amphip38基因參與先天免疫應(yīng)答。
　　(7)利用western blot技術(shù)檢測LPS注射后0.5h和1h，p38蛋白的磷酸化水平明顯增多，而在注射后的3h和6h下降。在蛋白水平上進(jìn)一步證實(shí)了Amphip38蛋白與哺乳動物p38蛋白有相同的功能機(jī)制，通過磷酸化激活參與文昌魚的先天免疫應(yīng)答。
　　總之，我們首次克隆了Amphip38基因并研究分析了Amp