低分子量肝素精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析研究.pdf

1、肝素是由糖醛酸和氨基葡萄糖以1→4糖苷鍵連接的二糖重復(fù)單元組成的線性多糖，其中糖醛酸殘基包括L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸，氨基葡萄糖為D-葡萄糖胺。肝素具有許多生理活性，參與細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移、免疫等重要生理過程。由于硫酸化修飾的差異，使肝素成份非常復(fù)雜，組成成份的定量分析對于了解其生物活性、質(zhì)量控制具有重要意義。低分子量肝素作為一種新型抗凝血藥物被廣泛用于預(yù)防和治療術(shù)后血栓栓塞性疾病。低分子量肝素在堿性條件下發(fā)生β-消除反應(yīng)降解引起

2、特殊化學(xué)鍵的斷裂生成1，6-成環(huán)衍生物，因此低分子量肝素與普通肝素相比結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。然而，對于低分子量肝素類藥物而言，低分子量肝素精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析研究是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的工作。本論文主要從以下分為三部分研究低分子量肝素的精細(xì)結(jié)構(gòu)，其具體內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　 1、本部分建立了一種新的基于毛細(xì)管電泳法測定低分子量肝素精細(xì)結(jié)構(gòu)的分析方法。低分子量肝素在肝素酶Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ完全酶解的條件下可以得到相應(yīng)的低聚糖。在120 mmol/L甲酸(pH

3、=3.4)緩沖液條件下，這些低聚糖可以得到非常有效的分離。在緩沖液中添加1％(w/v)PEG(10000)和2 mmol/L CaCl2可以有效提高核質(zhì)比非常接近低聚糖的分離度。在最佳的緩沖體系中，幾乎所有低聚糖都能達(dá)到基線分離和定量測定。低聚糖的電解遷移率與其核質(zhì)比呈線性關(guān)系，這有利于利用保留時(shí)間指認(rèn)出色譜圖上各個(gè)色譜峰。該方法重復(fù)性好，定量準(zhǔn)確。毛細(xì)管電泳法和離子交換色譜進(jìn)行比較，毛細(xì)管電泳分析低分子量肝素精細(xì)結(jié)構(gòu)分辨率更高。

4、>　　 2、本部分建立了用于分離并定量測定低分子量肝素中不同糖鏈長度的各個(gè)組份分布比例的體積排阻色譜方法。系統(tǒng)考察了流動(dòng)相的組成、離子強(qiáng)度和pH值、流速、柱溫等因素對分離的影響，確定的最佳分離條件為：兩根色譜柱TSK-GEL G2000SWx1(7.8 mm×300mm)串聯(lián)，流動(dòng)相100 mmol/L NH4Ac(pH=7.0)，流速0.5 mL/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量5μL，樣品濃度10 mg/mL。對方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進(jìn)行

5、了驗(yàn)證，一天之內(nèi)和天與天之間低分子硫酸化多糖各組成成份遷移時(shí)間和峰高的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別0.1%-1.5%和0.2%-6.9%。在最佳的分離條件下，可以將低分子量肝素樣品中不同糖鏈長度的各個(gè)組份分離并對各個(gè)組份的分布進(jìn)行了定量分析。用該方法對美國藥標(biāo)準(zhǔn)品(USP)、商品和杭州九源基因有限公司制備的低分子量肝素糖鏈長度分布進(jìn)行了定量對比。證明該方法可用于低分子量肝素類藥物的組成成份的質(zhì)量控制。
　　 3、本部分基于低分子量肝素各糖鏈