牛內(nèi)標準基因的基因組篩選及其在標準制定和肉制品鑒定中的應用.pdf

1、內(nèi)標準基因是在轉(zhuǎn)基因檢測標識制度中必需的檢測參照基因。內(nèi)標準基因具有物種專一性，且不顯示等位基因變異、拷貝數(shù)恒定的特點。物種專一性包含有種間特異性和種內(nèi)非特異性，種間特異性指其在不同的物種間序列很低的同源性，通過聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增僅可在目標物種內(nèi)擴增得到特異的預期產(chǎn)物;種內(nèi)非特異性指其在目標物種的不同品種中內(nèi)具有極少的等位基因變異及極高的同源性，通過PCR擴增可在各品種中得到

2、穩(wěn)定的預期產(chǎn)物。而非拷貝數(shù)變異基因在定量PCR檢測的過程中可用于基因組DNA的質(zhì)量或拷貝數(shù)的計算。在檢測體系中，利用PCR對受檢測樣品的基因組DNA進行擴增，通過以被轉(zhuǎn)入基因為檢測對象，以內(nèi)標準基因?qū)φ眨▋?nèi)標準基因?qū)φ?、陽性對照、陰性對照、空白對照），檢測結(jié)果可有效地判定受檢材料來源及PCR檢測體系工作正常與否;通過和轉(zhuǎn)入基因的想對定量結(jié)果比較，可進一步實現(xiàn)樣品中轉(zhuǎn)入基因的基因組水平定量分析。目前，所有已商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物品種均已開發(fā)出

3、了相應的內(nèi)標準基因檢測體系，有些品種已開發(fā)出多個內(nèi)標準基因;而針對轉(zhuǎn)基因動物的內(nèi)標準基因開發(fā)尚處于起步階段，本研究是針對普通牛(Bos taurus)開展的內(nèi)標準基因篩選及檢測體系建立工作。
　　 本研究旨在利用現(xiàn)有的基因組測序及注釋公共數(shù)據(jù)庫信息，借鑒、比較植物內(nèi)標準基因的研究模式，首先通過BLAST序列比對來尋找牛內(nèi)標準基因的候選基因。然后從種內(nèi)一致性和穩(wěn)定性、種間特異性、拷貝數(shù)穩(wěn)定等方面進行內(nèi)標準基因基因的篩選，經(jīng)過非牛物

4、種（水牛、山羊、綿羊、豬、鼠等）及不同的牛品種中的物種特異性PCR檢測，篩選出牛內(nèi)標準基因，從而為實施轉(zhuǎn)基因牛標識制度及檢測標準的研制提供依據(jù)。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.利用牛Ensembl基因注釋及UMD3.1測序等數(shù)據(jù)庫的蛋白與核酸序列信息和多物種蛋白/核酸序列庫（無亢余蛋白nr庫/核酸nt庫）進行BLASTp/BLASTn比對，篩選具有牛特異蛋白序列/核酸序列的基因138/69個，其中核酸及蛋白序列均特

5、異的基因48個，提供了這類特異基因的基因組水平匯總信息，為后續(xù)挖掘基因功能提供依據(jù);
　　 2.利用上述篩選出的基因序列，選擇大于200 bp的外顯子序列進行多物種核酸序列數(shù)據(jù)庫（無亢余核酸庫）BLASTn比對，并排除多拷貝和性染色體上基因及外顯子上核酸變異較多的候選基因，搜尋核酸特異序列，確定了9個基因作為牛內(nèi)標準基因的候選基因;
　　 3.對9個牛內(nèi)標準基因進行了比較和篩選，并根據(jù)候選基因設(shè)計特異引物的檢測結(jié)果及序列

6、結(jié)構(gòu)分析，篩選出牛腫瘤凋亡因子受體超家族成員10A（TumorNecrosis Factor Receptor Superfamily，member10a gene，TNFRSF10A）為牛內(nèi)標準基因。完成了該基因編碼序列的克隆測序。同核酸變異數(shù)據(jù)庫dbSNP比較發(fā)現(xiàn)，測序結(jié)果同數(shù)據(jù)庫記錄的序列信息和SNP位點位置、突變情況一致;
　　 4.根據(jù)篩選獲得的牛內(nèi)標準基因TNFRSF10A序列設(shè)計特異性PCR引物，分別進行引物優(yōu)化、