南海海洋微生物宏基因組文庫中酯酶基因的篩選與鑒定.pdf

1、自然環(huán)境中99％的微生物在目前的試驗條件不易獲得純培養(yǎng)，極大限制了人類對微生物遺傳資源的有效利用?，F(xiàn)代生物科技以及嚴峻的能源危機對新型工業(yè)用酶的需求日益旺盛，極大的促進了新型開發(fā)環(huán)境遺傳資源技術(shù)手段的發(fā)展。宏基因組學(xué)不依賴于微生物培養(yǎng)，提供了一個獲取寶貴未培養(yǎng)微生物遺傳資源的途徑。在本研究中，采用宏基因組學(xué)的方法構(gòu)建了一個高質(zhì)量的南海海洋微生物宏基因組文庫，通過高通量功能篩選，獲得了五個酯酶陽性克隆，對其中兩個具有較高活力的陽性克隆進行

2、亞克隆，通過測序鑒定了酯酶的編碼基因并分別命名為EstA和EstB，各自編碼一個277和328個氨基酸的蛋白。氨基酸序列比對和分子進化樹分析表明，EstA和在進化樹上相近的可能具酯類水解活力蛋白形成一個家族，并與脂肪酶/酯酶FamilyⅢ相近，EstB和在進化樹上相近的脂肪酶/酯酶形成了脂肪酶/酯酶FamilyⅣ的亞家族。定點突變試驗表明EstA含有一個經(jīng)典的催化三亞基結(jié)構(gòu)(S146-D222-H255)，而EstB含有一個不尋常的催化

3、三亞基，由S149-E243-H273組成，這個特殊的催化三亞基構(gòu)成這個亞家族的一個重要特征。異源表達純化蛋白后，對EstA和EstB分別進行了酶學(xué)性質(zhì)分析，結(jié)果表明EstA在多種陽離子中和高濃度的NaCl中表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性，反應(yīng)了取樣環(huán)境的高鹽多離子的特征。EstB活力不受PMSF抑制，表明EstB可能具有一個類似于脂肪酶的lid結(jié)構(gòu)。另外，EstB對對硝基苯酚酯類底物具有很高的催化活力，并且在30％的甲醇、乙醇、DMF、DMSO等有