甘蔗內標基因的篩選與鑒定.pdf

1、甘蔗是最重要的糖料作物，蔗糖占我國食糖總產量的90％以上，甘蔗生產關系我國食糖安全。甘蔗生產面臨寒、旱和病蟲害等逆境脅迫嚴重，提高甘蔗栽培品種的抗逆性是提高單產的重要手段?？紤]到甘蔗為異源多倍體和非整倍體植物，遺傳背景復雜，優(yōu)良基因聚合重組的概率僅1/300000，而轉基因甘蔗為安全風險等級最低的作物之一，又是營養(yǎng)繁殖作物，屬于轉基因改良容易成功的作物，因此，轉基因將有望作為甘蔗品種抗逆性改良的有效途徑和甘蔗育種新手段，而外源基因在轉基

2、因植株中的穩(wěn)定表達與外源基因拷貝數(shù)有密切關系，轉基因育種需要高通量的外源基因拷貝數(shù)檢測技術。經(jīng)典的Southern雜交技術存在費力、耗時和需要大量DNA等問題，且對于發(fā)生重排的外源基因拷貝數(shù)的測定不夠準確，因此，近年已在多種植物中建立了利用定量PCR進行基因拷貝數(shù)檢測的技術，該技術具有快速、高效和高通量的特點。另一方面，基因成分檢測是轉基因產品商業(yè)化過程中安全管理與監(jiān)控最重要的內容之一，隨著世界上第一例轉基因甘蔗在2013年獲準進行商業(yè)

3、種植，對轉基因甘蔗產品中基因成分檢測技術的需求更加迫切。而且，無論是轉基因甘蔗的外源基因拷貝數(shù)高通量檢測，還是轉基因甘蔗產品中基因成分檢測，均需要甘蔗源的內標準基因。
　　為此，在國家自然科學基金項目支持下，本研究利用定性PCR和定量PCR技術相結合，在克隆獲得6個甘蔗源候選內標準基因P4H，APRT，ENOL，CYC，TST和PRR的基礎上，以甘蔗ROC22和Badila基因組DNA為模板，對其相應的19對檢測引物進行特異性和擴

4、增效率評價，并進行種內非特異性和種間特異驗證；在初步估算上述基因拷貝數(shù)的基礎上，篩選低拷貝內標準基因，并在包括熱帶種、割手密野生種和現(xiàn)代甘蔗雜交種共8個不同甘蔗基因型上進行穩(wěn)定性分析。同時，通過構建多靶標標準質粒，在同一背景下進一步評價3個篩選出的低拷貝內標準基因的拷貝數(shù)與穩(wěn)定性，并與經(jīng)典的Southern雜交方法進行比較，建立了高通量檢測基因拷貝數(shù)的方法。主要結果與結論如下：
　　1、以甘蔗ROC22和Badila基因組DNA為

5、初始模板，通過定性PCR擴增，克隆測序比對，篩選出特異的候選內標準基因引物10對，分別是P4H基因的檢測引物P4H-1和P4H-3， ENOL基因的檢測引物ENOL-3，TST基因的檢測引物TST-1和TST-3，APRT基因的檢測引物APRT-1和APRT-2，CYC基因的檢測引物CYC-1和CYC-2以及PRR基因的檢測引物PRR-1。
　　2、利用定性PCR檢測技術，對所篩選的6個基因共10對引物在不同遺傳背景的甘蔗上進行種

6、內非特異性鑒定，同時，在水稻、玉米、高粱、小麥、大豆、棉花、油菜、煙草、擬南芥以及甜菜上進行種間特異性鑒定，篩選出了具有甘蔗特異性和種間特異性的基因檢測引物7對，分別是P4H基因的檢測引物P4H-1和P4H-3，APRT基因的檢測引物APRT-1和APRT-2，CYC基因的檢測引物CYC-1和CYC-2以及PRR基因的檢測引物PRR-1。
　　3、以甘蔗ROC22和Badila基因組DNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增，進一步

7、篩選出擴增效率高、特異性強的引物4對，分別是P4H基因的檢測引物P4H-3，APRT基因的檢測引物APRT-2，CYC基因的檢測引物CYC-2以及PRR基因的檢測引物PRR-1。
　　4、在比較4個候選內標準基因拷貝數(shù)的基礎上，篩選出潛在的低拷貝基因3個，分別是P4H，APRT和CYC基因；并在包括熱帶種、割手密野生種和現(xiàn)代甘蔗雜交種共8個不同甘蔗基因型上進行穩(wěn)定性分析，結果表明這3個基因在甘蔗基因組中，屬于甘蔗特異性和低拷貝基因

8、。
　　5、通過構建多靶標標準質粒，建立了P4H，APRT和CYC基因特異性定量方法，結果顯示，P4H，APRT和CYC基因在現(xiàn)代甘蔗栽培種ROC22基因組中的拷貝數(shù)分別為3，2和4，在熱帶種Badila基因組中分別為2，2和3，考慮到熱帶種為八倍體，現(xiàn)代栽培種中90%以上血緣來自熱帶種，說明了P4H，APRT和CYC基因是甘蔗基因組中的單拷貝或低拷貝基因。
　　6、為了比較定量PCR檢測與傳統(tǒng)的Southern雜交拷貝數(shù)鑒