海洋芽孢桿菌MP-2酯酶的分離純化、固定化及應(yīng)用研究.pdf

1、海洋芽孢桿菌M P ．2 酯酶的分離純化、固定化及應(yīng)用研究學(xué)位論文完成同期：指導(dǎo)教師簽字：答辯委員會(huì)成員簽字：海洋芽本實(shí)驗(yàn)室白海洋微生物中篩選出一株產(chǎn)羧酸酯酶的芽孢桿蔭( B a c i l l u sM P ．2 ) ，并對(duì)其產(chǎn)酯酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)以海洋芽孢桿菌酯酶為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行了分離純化及酶學(xué)性質(zhì)方面的研究；以殼聚糖為材料制備了凍干．P V A ．殼聚糖固定化酶，并對(duì)其在農(nóng)藥降解和手性拆分等領(lǐng)域的應(yīng)用做了系統(tǒng)

2、的探索。海洋芽孢桿菌酯酶發(fā)酵液通過離心( 1 0 0 0 0 r ／m i n 、4 “ C 、3 0 m i n ) 、5 0 K D a 濾膜超濾后得到粗酶液；粗酶液經(jīng)硫銨分級(jí)沉淀、P h e n y lS e p h a r o s eF F 疏水層析、QS e p h a r o s e H P 陰離子交換層析、S u p e r d e x Ⅲ2 0 0 凝膠柱層析、凍干等技術(shù)，最終得到電泳純的酯酶。S D S ．P A G

3、E 電泳結(jié)果表明，該酯酶表觀分子量為7 1 K D a 。以儀．乙酸萘酯為底物對(duì)酯酶進(jìn)行了理化性質(zhì)的初步研究，結(jié)果表明：酯酶的最適反應(yīng)溫度為5 0 。C ，最適p H 值為8 ．0 ，屬于熱穩(wěn)定性良好的堿性酯酶。以殼聚糖、聚乙烯醇( P V A ) 、戊二醛等為材料，利用吸附、交聯(lián)的原理，通過凍干技術(shù)制備了凍干．P V A ．殼聚糖同定化酯酶。并通過單岡素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，確定了固定化酶生產(chǎn)的適宜條件：殼聚糖濃度3 ％、P V A 濃度3 ∥L

4、 、酶液固定化載體體積質(zhì)量比5 ／2 m l ／g ，戊二醛濃度0 ．4 ％，交聯(lián)時(shí)間3 0 m i n ，此時(shí)同定化酶活力回收率為7 3 ．8 ％。酯酶經(jīng)固定化后，熱穩(wěn)定一H - 茅i l 抗酸堿能力有明_ ! I I ! 提升；在6 0 ℃，p H 7 ．0 的反應(yīng)體系中活性最大；使』{ j5 次后，固定化酶載體形狀基本沒變化，活性保留了7 l ％。利用凍干．P V A ．殼聚糖固定化酯晦來降解農(nóng)藥西維因，并通過詐交試驗(yàn)，得出了降解

5、反應(yīng)的最佳條件，即在p H 7 ．0 、溫度6 0 ℃、加酶量O ．4 2 、反應(yīng)7 0 m i n 時(shí)，固定化酶對(duì)西維因的降解率達(dá)到最大值8 3 ．4 ％。在酯酶降解西維因的反應(yīng)體系中，加入不同的會(huì)屬離子，會(huì)對(duì)降解率有所影響，其中，K + 、C a 2 + 對(duì)降解反應(yīng)有一定的促進(jìn)作用，而A g + 、F e 3 + 的抑制作用最為顯著。利用凍干．P V A ．殼聚糖固定化酯酶水解D ．泛解酸內(nèi)酯、用H P L C 對(duì)反應(yīng)過程進(jìn)行監(jiān)控，