建立免疫親和柱聯(lián)合高效液相色譜法檢測(cè)蘇丹紅Ⅰ.pdf

1、本研究采用環(huán)氧氯丙烷活化瓊脂糖凝膠4FF(Sepharose4FF),通過(guò)ε-氨基己酸(AHA)修飾,獲得免疫親和基質(zhì),并與抗蘇丹紅Ⅰ單克隆抗體偶聯(lián),制備蘇丹紅Ⅰ免疫親和柱,同時(shí)建立了免疫親和柱聯(lián)高效液相色譜法(Immunoaffinity column—High Performance Liquid Chromatography,IAC-HPLC)檢測(cè)辣椒粉加標(biāo)樣品中的蘇丹紅Ⅰ。研究結(jié)果如下:
　　 1、瓊脂糖凝膠Sephar

2、ose4FF的活化與修飾
　　 采用環(huán)氧氯丙烷法活化Sepharose4FF,對(duì)Sepharose4FF預(yù)處理、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、DMSO百分比、NaOH濃度和環(huán)氧氯丙烷百分比分別進(jìn)行優(yōu)化,確定了40℃反應(yīng)2 h20 min、46.8％DMSO、30％ECH和NaOH初始濃度為8 mol／L、終濃度為0.8 mol／L為最佳反應(yīng)條件,在此條件下,環(huán)氧基活化率能到達(dá)80μmol／g。采用ε-氨基己酸為間隔臂修飾環(huán)氧氯丙烷法活化的

3、Sepharose4FF(Sepharose4FF-epoxy),確定了以pH8.30.1 mol／LNaHCO3含0.5 mol／LNaCl、25℃偶聯(lián)8.5 h為最佳反應(yīng)條件。
　　 2、Sepharose4FF-epoxy-ε-氨基己酸與配體的偶聯(lián)反應(yīng)
　　 將Sepharose4FF-epoxy-ε-氨基己酸與氨基化蘇丹紅反應(yīng),對(duì)反應(yīng)條件EDAC濃度、反應(yīng)溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化,確定了以EDAC濃度為19 mg／mL

4、、27℃、16h為最佳反應(yīng)條件。氨基與羧基偶聯(lián)過(guò)程中,考慮到溫度過(guò)高會(huì)造成抗體活性的破壞,在4℃條件下,進(jìn)一步優(yōu)化,確定了以EDAC濃度為19mg／mL、反應(yīng)72h為最佳反應(yīng)條件。
　　 3、抗SudanⅠ單克隆抗體免疫親和柱的制備
　　 將辛酸-硫酸銨法純化的抗SudanⅠ單克隆抗體與ε-氨基己酸修飾的瓊脂糖凝膠Sepharose4FF偶聯(lián)。采用HPLC方法檢測(cè)免疫親和柱的柱容量。抗SudanⅠ單克隆抗體免疫親和柱以0

5、.3 g帶羧基的瓊脂糖凝膠4FF與1 mg蘇丹紅Ⅰ單抗偶聯(lián),柱容量為1.6μg。
　　 4、建立IAC-HPLC檢測(cè)蘇丹紅Ⅰ
　　 將蘇丹紅Ⅰ樣品過(guò)免疫親和柱,乙腈洗脫后以高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè),紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為478 nm,流動(dòng)相為0.1％甲酸水溶液-乙腈-0.1％甲酸乙腈溶液-丙酮(體積比為21.25:3.75:60:15)。對(duì)免疫親和柱的操作條件即上樣緩沖液、上樣方式、洗脫液體積進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)免疫親和柱的穩(wěn)定