新型脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖骨組織工程支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)利用豬股骨制備新型脫細(xì)胞骨基質(zhì)(acellular bone extracellularmatrix,ABECM)材料及脫細(xì)胞骨基質(zhì)-殼聚糖(Chitosan,CS)骨組織工程復(fù)合多孔支架,檢測(cè)其理化性能和生物相容性,探討其成為骨組織工程支架材料的可行性,為組織工程骨支架的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：⑴采用Triton X-100和十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)等聯(lián)合脫細(xì)胞

2、方法對(duì)豬股骨干進(jìn)行處理,對(duì)ABECM材料進(jìn)行定性分析。應(yīng)用溶液共混、冷凍干燥法制備脫細(xì)胞骨基質(zhì)/殼聚糖(ABECM/CS)骨組織工程復(fù)合支架,對(duì)復(fù)合多孔支架進(jìn)行組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、掃描電鏡、孔隙率、力學(xué)性能等特性進(jìn)行檢測(cè)分析。⑵分離、培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymalstem cells,BMSCs),傳代后將細(xì)胞與支架復(fù)合共同培養(yǎng),觀察細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)與增殖情況；采用MTT法觀察材料浸提液于1、3

3、、5、7天時(shí)進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的活性；將材料浸提液與稀釋血混合離心后觀察紅細(xì)胞溶血情況,檢測(cè)OD值計(jì)算相對(duì)溶血率；將材料浸提液經(jīng)靜脈注入兔體內(nèi)進(jìn)行熱原實(shí)驗(yàn),在規(guī)定時(shí)間內(nèi)觀察兔體溫變化。
　　 結(jié)果：①ABECM材料及ABEcM-CS復(fù)合支架HE染色、Hoechest33258熒光染色均無細(xì)胞殘留,甲苯胺蘭、蕃紅O染色、茜素紅染色染色陽(yáng)性,Ⅰ型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2抗體免疫組織化學(xué)染色陽(yáng)性。掃描電鏡和Mioro-CT顯示A

4、BECM-CS支架具有多孔結(jié)構(gòu),孔徑50-200μm,孔隙率為(53.50±4.23)％,力學(xué)檢測(cè)支架在干燥狀態(tài)下縱向壓縮模量為(33.23±14.45)Mpa,支架濕潤(rùn)狀態(tài)下的壓縮模量為(2.27±1.13)Mpa。②細(xì)胞-支架復(fù)合培養(yǎng)試驗(yàn)顯示細(xì)胞黏附與生長(zhǎng)良好,死活細(xì)胞染色可見支架上粘附活細(xì)胞,支架周圍細(xì)胞生長(zhǎng)活躍細(xì)胞伸出偽足,相互之間連接,并有基質(zhì)成分產(chǎn)生。細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示,培養(yǎng)1、3、5、7天后各時(shí)間段內(nèi)三組OD值兩兩比較(P>

5、0.05),無顯著差異,表明材料無毒性。在溶血試驗(yàn)中,觀察實(shí)驗(yàn)材料的溶血率為3.0％,在生物材料標(biāo)準(zhǔn)值溶血率5％范圍內(nèi),提示無溶血現(xiàn)象發(fā)生。熱原實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示每只兔體溫升高均低于0.6℃,且3只兔體溫升高總度數(shù)低于1.4℃,符合熱原檢測(cè)規(guī)定,復(fù)合材料無致熱作用。
　　 結(jié)論：⑴經(jīng)聯(lián)合脫細(xì)胞處理得到的ABECM材料與CS溶液共混、冷凍干燥法所制備的ABECM/CS復(fù)合多孔支架去細(xì)胞徹底,保留了脫細(xì)胞骨基質(zhì)主要成分,具備合適的孔徑和孔