包裹BMSCs殼聚糖水凝膠復(fù)合CPC骨組織工程支架的構(gòu)建及治療骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的殼聚糖/β-甘油磷酸鈉水凝膠的制作及相關(guān)研究
　　目的:研究溫敏型殼聚糖/β-甘油磷酸鈉(chitosan/β-glycerol phosphate C/GP)水凝膠的制作以及作為細(xì)胞載體對其中的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyme stem cells, BMSCs)粘附、生長、和增殖的影響。
　　方法:將殼聚糖(chi

2、tosan, CS)與β-甘油磷酸鈉(β-glycerol phosphate,GP)按照3:1的比例混合后放置于37℃溫度條件下可形成固態(tài)水凝膠。將體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的兔 BMSCs與 C/GP溶液混合、固化形成水凝膠后制作冰凍切片行蘇木素-伊紅(HE)染色觀察其粘附和生長情況;通過 CCK8法和死/活細(xì)胞熒光染色法檢測 BMSCs在 C/GP水凝膠中的生長、增殖情況。
　　結(jié)果:BMSCs/C/Gp混合溶液置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)l0m

3、ins可固化形成水凝膠。BMSCs與C/GP溶液混合培養(yǎng)14天后,細(xì)胞增值數(shù)量多,其形態(tài)為長梭形,伸展良好。冰凍切片HE染色顯示:C/GP水凝膠呈現(xiàn)均質(zhì)紅染,有孔隙樣結(jié)構(gòu);BMSCs分布較均勻,形態(tài)大部分為圓形,胞核藍(lán)染,呈圓形或橢圓形。CCK8法測定實(shí)驗(yàn)組光吸收值與對照組比較,除第2天有顯著性差異(P<0.05)外,第4、6、8天比較均無顯著性差異(P>0.05)。死/活細(xì)胞熒光染色顯示:培養(yǎng)14天后,實(shí)驗(yàn)組中BMSCs絕大多數(shù)被染成

4、綠色,極少量死細(xì)胞被染成紅色。細(xì)胞形態(tài)為多邊形,伸展良好?；罴?xì)胞比率和活細(xì)胞密度與對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。
　　結(jié)論:C/Gp溫敏型水凝膠在接近于人體內(nèi)體溫的條件下可長期保持水凝膠狀態(tài),C/Gp溫敏型水凝膠對 BMSCs無細(xì)胞毒性且適合細(xì)胞粘附和生長,為進(jìn)一步試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 新型磷酸鈣骨水泥材料的制作及其細(xì)胞毒性、機(jī)械性能、孔隙結(jié)構(gòu)的相關(guān)研究
　　目的:探討新型大孔隙磷酸鈣骨水泥(ca

5、lcium phosphate cement,CPC)材料支架的細(xì)胞毒性和對細(xì)胞粘附、生長和增殖的影響。
　　方法:新型 CPC在固相的混合過程中,首先將細(xì)化后的磷酸四鈣(tetracalcium phosphate, TTCP)和磷酸氫鈣(dicalcium phosphate anhydrous, DCPA)粉末按1:1(摩爾比)的比例配制成 CPC固體粉末;再將質(zhì)量比為50％的水溶性甘露醇晶體加入到CPC固體粉末中用來制造大

6、孔隙。應(yīng)用磷酸鹽緩沖液為固化液。將 CPC固體粉末與固化液按照2g:1ml的比例在研缽中混合均勻,得到糊狀混合物,即 CPC面團(tuán)。通過CCK8法檢測細(xì)胞在新型 CPC材料浸提液中的生長增殖情況;通過電子掃描電鏡測試材料孔徑;應(yīng)用力學(xué)三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)測試新型 CPC的生物力學(xué)性能。
　　結(jié)果:通過掃描電鏡觀察和測量,新型 CPC材料的孔徑值達(dá)到267.43±118.01μm,而傳統(tǒng) CPC材料的孔徑值只有6.66±2.58μm,兩者比較

7、具有顯著性差異(p<0.05);新型CPC材料孔隙率為66.15±6.91％,傳統(tǒng) CPC材料孔隙率為35.02±4.71％,兩者比較具有顯著性差異(p<0.05)。新型 CPC材料的最大負(fù)荷、抗彎強(qiáng)度和堅(jiān)韌度較傳統(tǒng) CPC均增加了約1倍(p<0.05),明顯提高了其負(fù)荷承載能力。CCK8法檢測出新型 CPC材料浸提液與細(xì)胞共培養(yǎng)不同時間后其光密度值(optical density value, OD)值與陰性對照組均無顯著性差異(p>

8、0.05)。新型 CPC材料細(xì)胞毒性評級為1級,即該材料對BMSCs無明顯毒性。
　　結(jié)論:新型 CPC材料具有強(qiáng)大的生物力學(xué)性能、大孔隙、高孔隙率和良好的生物相容性,有望成為理想的骨組織工程支架。
　　第三部分 新型磷酸鈣骨水泥混合材料(包含包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的殼聚糖水凝膠和甘露醇晶體)中細(xì)胞活性和成骨分化的相關(guān)研究
　　目的:研究溫敏型C/GP水凝膠對包裹其中的BMSCs在CPC自凝固化過程中的保護(hù)作用以及BMS

9、Cs在新型CPC混合材料(包含包裹骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的殼聚糖水凝膠和甘露醇晶體)中的粘附、增殖和成骨分化情況。
　　方法:將體外培養(yǎng)、擴(kuò)增的兔 BMSCs與 C/GP溶液混合置于培養(yǎng)板底層,放置37℃條件下固化形成水凝膠;將 CPC面團(tuán)置于培養(yǎng)板中水凝膠層的上方,放置37℃條件下固化。通過 CCK8法和死/活細(xì)胞熒光染色法檢測包裹于 C/GP水凝膠中的BMSCs通過 CPC自凝固化過程后的細(xì)胞生存及增殖活性;通過組織化學(xué)方法檢測堿性

10、磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)活性;茜素紅染色檢測鈣化結(jié)節(jié)的表達(dá),RT-PCR檢測 ALP和降鈣素(calcitonin, CT)mRNA的表達(dá)。通過電子掃描電鏡觀察 BMSCs在新型 CPC材料中的生長及粘附情況。
　　結(jié)果:包裹于 C/GP水凝膠中的BMSCs在 CPC材料中培養(yǎng)14天后的死/活細(xì)胞熒光染色顯示:活細(xì)胞比率為(78.77±2.66)％,同單純 BMSCs細(xì)胞懸液組(82.07±4.

11、30)％和C/GP水凝膠組(80.03±3.08)％比較無顯著性差異(p>0.05);活細(xì)胞密度為(82.54±4.17)％,同單純 BMSCs細(xì)胞懸液組(86.37±4.81)％和C/GP水凝膠組(83.63±5.20)％比較亦無顯著性差異(p>0.05)。包裹于C/GP水凝膠中的BMSCs在CPC材料中使用成骨培養(yǎng)基培養(yǎng)7天和14天后,ALP、茜素紅染色均為陽性同對照組無差異(p>0.05);RT-PCR結(jié)果亦顯示 ALP和CT的m

12、RNA基因表達(dá)明顯增強(qiáng)。BMSCs在新型 CPC復(fù)合支架材料上培養(yǎng)5天掃描電子顯微鏡顯示 BMSCs向 CPC材料的孔隙深部長入并且緊緊地附著在類似納米羥基磷灰石骨礦物質(zhì)材料上。
　　結(jié)論:溫敏型 C/GP水凝膠對包裹其中的BMSCs在 CPC自凝固化過程中可起到保護(hù)作用,新型 CPC復(fù)合支架材料無細(xì)胞毒性,其三維孔隙結(jié)構(gòu)及材料特性適合 BMSCs粘附、生長、增殖和成骨分化。
　　第四部分 兔橈骨缺損模型制作及新型磷酸鈣骨水

13、泥材料對骨折缺損模型的治療效果
　　目的:研究兔橈骨缺損模型的制作以及觀察新型 CPC材料對兔橈骨缺損模型的修復(fù)治療效果。
　　方法:選用12只成年健康的新西蘭大白兔沿其雙側(cè)前臂橈側(cè)暴露橈骨中段截取約1cm骨干制造骨缺損模型。其中6只為試驗(yàn)組植入新型 CPC,另6只為對照組植入傳統(tǒng)CPC。分別于手術(shù)當(dāng)天、術(shù)后第4周、8周和第12周行雙上肢 X線片檢查,于術(shù)后第12周行雙上肢 MRI檢查、組織切片 HE染色觀察和生物力學(xué)測定。

14、
　　結(jié)果:新型 CPC材料植入兔橈骨缺損處后未出現(xiàn)炎性、排斥等不良反應(yīng)。術(shù)后第4周、8周和12周 X線片檢查顯示試驗(yàn)組骨折缺損修復(fù)情況明顯優(yōu)于對照組。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后12周螺旋 CT三維重建可見橈骨缺損區(qū)域與周圍正常骨質(zhì)整合完整,骨組織爬行替代理想,骨折缺損間隙模糊消失。對照組橈骨缺損區(qū)域植入的傳統(tǒng) CPC材料降解吸收,骨折缺損依舊存在,與周圍正常骨質(zhì)無明顯連接整合。術(shù)后第12周,通過組織形態(tài)學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)組成骨及塑形等方面明顯優(yōu)于對照組