適用于大樣本高分辨三維成像的樹(shù)脂塊連續(xù)薄切片研究.pdf

1、近來(lái)興起的腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)精細(xì)結(jié)構(gòu)的研究,需要能夠在哺乳動(dòng)物全腦范圍實(shí)現(xiàn)神經(jīng)突起甚至突觸分辨率水平的解剖結(jié)構(gòu)成像的技術(shù)。根據(jù)這一需求,已發(fā)展出許多新的成像方法和成像系統(tǒng)。基于樹(shù)脂包埋和薄切片的顯微成像技術(shù),被認(rèn)為是目前最可能實(shí)現(xiàn)全腦精細(xì)神經(jīng)連接結(jié)構(gòu)獲取的方法之一。當(dāng)這類(lèi)技術(shù)應(yīng)用于小鼠全腦這種厘米尺寸大樣本時(shí),薄切片的加工性能和穩(wěn)定性對(duì)海量地長(zhǎng)時(shí)間微米分辨率獲取神經(jīng)精細(xì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的質(zhì)量具有至關(guān)重要的影響。然而目前還缺少對(duì)連續(xù)薄切片尤其是大樣本的

2、連續(xù)薄切片的系統(tǒng)性的研究。
　　顯微光學(xué)切片斷層成像(Micro-opticalSectioningTomography,MOST)技術(shù)是基于樹(shù)脂包埋和薄切片的顯微成像技術(shù)的一個(gè)代表,主要致力于研究各種染色的小鼠全腦的高分辨率成像。MOST技術(shù)通過(guò)對(duì)小鼠全腦組織用樹(shù)脂包埋后進(jìn)行厚度為0.5-1μm的連續(xù)自動(dòng)薄切片和成像,實(shí)現(xiàn)海量數(shù)據(jù)獲取。本文以MOST系統(tǒng)為實(shí)驗(yàn)平臺(tái),建立用于大樣本三維高分辨成像的樹(shù)脂連續(xù)薄切片性能的定量評(píng)估和研究

3、方法,并以Spurr樹(shù)脂為代表的環(huán)氧類(lèi)樹(shù)脂樣本為對(duì)象,研究MOST系統(tǒng)微米切片性能。
　　由于大樣本薄切片的直接測(cè)量實(shí)施的難度大,可靠性低,故提出了基于加工表面形貌測(cè)量的性能評(píng)估的基本思想,并闡述了該方法的總體方案、技術(shù)選擇、以及評(píng)估和優(yōu)化的標(biāo)準(zhǔn)。
　　表面波紋度、表面粗糙度、切片厚度與切片圖像質(zhì)量和三維重建準(zhǔn)確性直接相關(guān)。通過(guò)表面波紋曲線、三維形貌和臺(tái)階高度的獲取與測(cè)量對(duì)這三項(xiàng)基本性能進(jìn)行研究。MOST系統(tǒng)的具體實(shí)驗(yàn)研究表

4、明,MOST系統(tǒng)微米切片Spurr樹(shù)脂應(yīng)避免使用會(huì)造成振動(dòng)和表面波紋加強(qiáng)的F300切片速度,并保證樣本的邵氏硬度在80以上,由此可在非切片邊界處獲得Rq低于20nm、Rz低于200nm的高質(zhì)量表面;通過(guò)刀刃滾動(dòng)角的調(diào)節(jié),微米切片的厚度變動(dòng)范圍可以控制在10％以內(nèi)。
　　大樣本的薄切片會(huì)經(jīng)歷同一斷面分解為多條切片的過(guò)程,帶來(lái)切片條帶的橫向配準(zhǔn)和邊界損失問(wèn)題,并可能直接影響三維圖像數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和完整性。首次提出基于表面鋸齒高度的刀刃滾

5、動(dòng)角測(cè)量方法,并以此評(píng)估條帶的橫向配準(zhǔn)程度。利用掃描電子顯微鏡研究條帶邊界的損失,以邊界缺口寬度評(píng)價(jià)邊界損失。MOST系統(tǒng)微米切片Spurr樹(shù)脂實(shí)驗(yàn)說(shuō)明:加工表面鋸齒高度越大,橫向條帶錯(cuò)位和邊界缺口寬度越大;較軟的樣本更易產(chǎn)生面積較大的邊界缺口。通過(guò)調(diào)整刀刃滾動(dòng)角將加工表面鋸齒高度控制在200-300nm,并盡量采用較硬的樣本(推薦1＃邵氏硬度,約83.5度),可將橫向切片配準(zhǔn)偏差控制在20%~30%,邊界缺口寬度控制在MOST成像橫向

6、分辨率(0.71μm)以下。結(jié)合微米臺(tái)階高度和鋸齒高度的測(cè)量,精確計(jì)算了MOST微米切片Spurr樹(shù)脂的實(shí)際平均切片厚度,與設(shè)定值1μm的偏差不超過(guò)3%。
　　大樣本薄切片的實(shí)施必須在水中進(jìn)行,水會(huì)使得樹(shù)脂材料膨脹甚至軟化,對(duì)切片性能可能會(huì)有影響。針對(duì)水環(huán)境下切片性能進(jìn)行研究和優(yōu)化,首次提出了基于表面臺(tái)階高度測(cè)量的樣本表面短時(shí)間浸水膨脹程度的定量研究方法,并用于Spurr樹(shù)脂塊的吸濕性膨脹特性研究。根據(jù)Spurr樹(shù)脂吸濕性膨脹特性

7、,應(yīng)保證同一層斷面中各切片條帶的浸水時(shí)間一致且盡可能短,一般控制在4分鐘以內(nèi),浸水時(shí)間超過(guò)8分鐘,可能引起加工表面力學(xué)性能退化從而造成嚴(yán)重?cái)?shù)據(jù)損失。利用邵氏硬度測(cè)量對(duì)Spurr樹(shù)脂浸水后硬度的變化進(jìn)行研究,認(rèn)為25℃的水溫和不低于1mm/24h的表面更新速度,基本可以避免水環(huán)境降低Spurr樹(shù)脂切片性能。
　　本文實(shí)驗(yàn)研究獲得一系列優(yōu)化切片性能的條件參數(shù),并表明MOST系統(tǒng)運(yùn)行在可選參數(shù)條件下,能實(shí)現(xiàn)高精度和長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定的微米切片工