熒光全場三維納米分辨顯微成像研究.pdf

1、要理解一個復(fù)雜的生物學(xué)系統(tǒng)，對活體細(xì)胞內(nèi)的分子及其相關(guān)事件以高的空間和時間分辨率實現(xiàn)可視化、跟蹤和定量處理是必不可少的。這就要求作為細(xì)胞內(nèi)生命活動直接可視化工具的光學(xué)顯微鏡必須具備幾個特點：分子識別、納米的空間分辨、單分子的探測靈敏度、μs 乃至ps的時間分辨。后面兩項要求，靈敏度和時間分辨主要是對探測器的要求。至于前面兩項要求，對于熒光顯微成像來說，由于熒光探針可對特定生物分子進(jìn)行特異性標(biāo)記，因此具有良好的分子識別能力。在空間分辨率方

2、面，傳統(tǒng)的熒光顯微成像受到衍射極限的限制。然而，隨著激光技術(shù)、分子探針材料、熒光標(biāo)記技術(shù)、弱光探測技術(shù)的不斷發(fā)展，新的成像方法和手段不斷被提出和實現(xiàn)，曾經(jīng)認(rèn)為不可逾越的極限分辨正在通過各種渠道被打破。本論文在深入調(diào)研和分析目前納米分辨光學(xué)成像方法的基礎(chǔ)上，考慮到未來應(yīng)用于活細(xì)胞及其間的動態(tài)過程研究的可能性，本論文重點研究圖像信息獲取速率高的寬場成像方法，即結(jié)構(gòu)光照明和單分子定位三維納米分辨顯微成像，并試圖在方法上解決厚樣品納米分辨顯微成

3、像問題?，F(xiàn)將已完成的工作總結(jié)如下：
　　 (1)基于可編程的數(shù)字微鏡器件（DigitAlMirror Device，DMD）的結(jié)構(gòu)光照明顯微成像研究
　　 本論文采用可編程器件DMD代替光柵，作為結(jié)構(gòu)光照明裝置，用計算機編程控制DMD上的微鏡on/off 狀態(tài)，來獲得所需的結(jié)構(gòu)光照明光柵圖案及相應(yīng)的相移，從而替代光柵相移所需的機械平移裝置，通過不同的算法提高軸向和橫向空間分辨率。利用一個簡單的小孔作為低通空間濾波裝置，使

4、得結(jié)構(gòu)光圖案的各級衍射中，只有0級和正負(fù)一級衍射通過。在這種照明條件下，使用改進(jìn)后的層析算法，通過5 步相移法獲得了兩個不同層析能力的層析圖像。結(jié)果表明在重構(gòu)的層析圖像中，離焦信息可以被有效濾除。同時，在模擬結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用結(jié)構(gòu)光照明實現(xiàn)了對生物樣品的超分辨成像。
　　 (2) 單分子定位顯微成像研究
　　 本論文在一定衍射極限下，模擬并分析了單分子被探測到的光子數(shù)、探測器有效像元大小和背景噪聲不同時，單分子定位精度的

5、變化。用Matlab 程序?qū)崿F(xiàn)了單分子定位顯微的模擬成像及圖像重構(gòu)。采用單分子模型和呈線條排列的分子模型進(jìn)行模擬。單分子模型蒙特卡洛模擬的分辨率與解析理論結(jié)果幾乎一致。而對成條帶排列的分子模型的模擬結(jié)果表明，該程序可分辨中心間隔為20nm的兩條分子帶。在IX 71倒置熒光顯微鏡上，利用640nm 波長的光同時作為激活光、去激活光和激發(fā)光，實現(xiàn)了單分子定位納米分辨顯微成像，實測空間分辨率達(dá)到48 nm。在源圖像重構(gòu)程序驗證和系統(tǒng)穩(wěn)定性驗證

6、的基礎(chǔ)上，實現(xiàn)了對HeLa細(xì)胞突起中微絲束結(jié)構(gòu)的納米分辨成像。
　　 (3) 雙波長非相干光干涉照明實現(xiàn)軸向選擇性激發(fā)研究
　　 本論文分析了單分子定位顯微成像用于厚樣品成像時存在的問題，表明在現(xiàn)有條件下，由于非焦平面被激發(fā)分子的熒光干擾帶來的背景噪聲，導(dǎo)致其成像深度是有限的。目前，國際上通過斜照射獲得的納米分辨樣品厚度不超過3 微米。為了解決此難題，本論文提出利用單一薄層的軸向選擇性激發(fā)的技術(shù)途徑。其核心是雙波長非相干

7、光干涉照明實現(xiàn)軸向選擇性激發(fā)。利用多數(shù)開關(guān)分子所具有的開關(guān)速率隨激活光、去激活光成正比的特性，通過軸向調(diào)制的激活光（焦平面強度為極大值）和去激活光（焦平面強度為極小值）配合，利用軸向不同位置上激活光和去激活光的強度比變化，實現(xiàn)熒光分子處于熒光態(tài)概率的軸向調(diào)制。當(dāng)去激活光為空間非相干光時，可以實現(xiàn)單一薄層的選擇性激發(fā)。在對其中幾個關(guān)鍵技術(shù)討論的基礎(chǔ)上，本論文對雙波長非相干光干涉照明實現(xiàn)軸向選擇性激發(fā)進(jìn)行了論證：采用這種照明方式，開關(guān)分子處

8、于熒光態(tài)的概率沿軸向的分布中只有一個峰，最大值位于焦平面，該峰的FWHM 約為35nm；在除焦平面上下幾十納米的范圍之外，開關(guān)分子處于熒光態(tài)的平均概率只有焦平面處概率的6％以下。模擬結(jié)果表明該照明方式可以極大地抑制背景噪聲。
　　 本論文的主要創(chuàng)新點在于，針對單分子定位顯微用于厚樣品成像時存在的非焦平面噪聲問題，創(chuàng)造性地提出雙波長非相干光干涉照明方法，理論證明了其可用于實現(xiàn)對厚樣品內(nèi)任意深度上厚度約為35nm的單一薄層的軸向選擇