幽門螺桿菌感染的致病機制及其免疫防治的動物實驗研究.pdf

1、目前,探討COX在胃粘膜炎癥中的作用主要是通過對NSAIDs的研究實現(xiàn)的.因此,該研究利用Hp感染的野生型和COX基因敲除小鼠模型,在Hp誘導(dǎo)慢性胃炎過程中COX-1和COX-2對胃粘膜的炎癥程度、胃上皮細胞的凋亡和增殖、細胞因子的表達以及PGE<,2>、LTB<,4>和LTC<,4>生成等方面的作用進行了較為系統(tǒng)的探索.材料和方法一.幽門螺桿菌感染環(huán)氧合酶基因敲除小鼠模型的建立及評價1.實驗動物及其基因鑒定本研究所采用的COX基因敲除

2、小鼠是COX-1基因敲除小鼠的雜合子(COX-1+/-)、純合子(COX-1-/-)和COX-2基因敲除小鼠的雜合子(COX-2+/-)、純合子(COX-2-/-)以及相同種屬的野生型(WT)小鼠.通過提取尾組織DNA,用PCR方法進行基因表型的鑒定.2.實驗動物分組及處理經(jīng)鑒定后的小鼠隨機分為Hp感染的WT組、COX-1+/-組、COX-1-/-組、COX-2+/-組和COX-2-/-組以及相應(yīng)的對照組.用Hp TN2菌株灌胃動物;對

3、照組給予相同量的布氏肉湯.在Hp接種24周后處死動物,取胃組織進行各指標的檢測.3.定量細菌培養(yǎng)鼠胃稱重后勻漿.勻漿液經(jīng)1O和100倍稀釋后,分別取1OOμl接種于改良Skirrow選擇性瓊脂平板上,于37℃微需氧條件下培養(yǎng)5~7天,計數(shù)Hp菌落數(shù).Hp定植密度(CFUs/g組織)=Hp菌落數(shù)×稀釋度/胃重量.4.胃組織COX蛋白表達的檢測(免疫印跡法)小鼠胃組織經(jīng)勻漿后離心.取上清,測定其蛋白濃度.將含蛋白50μg的每個樣品進行SDS

4、-PAGE電泳.分離凝膠,用轉(zhuǎn)移緩沖液浸泡后,與PVDF膜對齊、貼緊,在電轉(zhuǎn)移儀中92 mA電轉(zhuǎn)3 hr.取出硝酸纖維素膜,用含5％脫脂牛奶的TBST室溫下封閉1 hr后,加入一抗(1:100)室溫下孵育1 hr.經(jīng)TBST洗滌后,再加二抗(1:3000),室溫下孵育1 hr,膜再經(jīng)TBST洗滌后,用ECL化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測.5.組織學(xué)檢查將胃組織以10%的中性福爾馬林固定及石蠟包埋后切片,做常規(guī)H&E和改良Giemsa染色.按新悉尼

5、系統(tǒng)標準中的淋巴細胞和粒單細胞的浸潤程度對胃炎做分級評分.通過改良Giemsa染色觀察Hp的定植情況.二.環(huán)氧合酶基因敲除對幽門螺桿菌感染的胃上皮細胞凋亡和增殖及炎癥介質(zhì)生成的影響1.胃粘膜上皮細胞凋亡和增殖的檢測根據(jù)試劑盒的說明,用原位末端轉(zhuǎn)移酶標記(TUNEL)法檢測胃上皮細胞的凋亡.用免疫組織化學(xué)法檢測Ki-67的表達來觀察胃上皮細胞的增殖情況.2.胃組織細胞因子的半定量RT-PCR檢測提取胃粘膜組織總RNA,然后將RNA反轉(zhuǎn)錄成

6、cDNA.取2μl cDNA進行PCR擴增.PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,并拍照和分析結(jié)果.采用β-actin作為半定量內(nèi)參照,計算各細胞因子mRNA的相對表達水平.3.胃粘膜組織PGE<,2>、LTB<,4>和LTC<,4>水平的ELISA檢測胃組織經(jīng)稱重后,放入組織裂解液中進行勻漿,將勻漿液在冰浴下進行超聲粉碎,再低溫離心,留上清,根據(jù)試劑盒的要求進行操作.結(jié)論1.COX-1和COX-2基因敲除對Hp在小鼠胃粘膜的定植水平無明顯影響

7、.2.COX-1和COX-2基因敲除都加重了小鼠Hp相關(guān)性胃炎炎癥的程度,這種作用可能主要是通過上調(diào)促炎細胞因子IFN-γ、IL-12和TNF-α的表達實現(xiàn)的.3.COX-2基因敲除可使Hp感染所致的小鼠胃上皮細胞的增殖減少,而對凋亡無明顯影響,表明COX-2基因敲除提高了Hp感染引起的凋亡與增殖之間的比率,這種作用可能在減少Hp誘導(dǎo)胃癌的形成中起一定的作用.4.無論有無Hp感染,COX-1基因敲除使小鼠胃粘膜PGE<,2>生成明顯減少

8、,且在無Hp感染時未引起明顯的胃粘膜病變,提示在無損害因素的前提下,單一的缺少PGE<,2>不會對胃粘膜的正常結(jié)構(gòu)造成損害.5.Hp感染使野生型和COX基因敲除小鼠胃組織LTB<,4>和LTC<,4>的生成都明顯增加,但在后者未見進一步增加,表明LTB<,4>和LTC<,4>雖參與了Hp相關(guān)性胃炎的形成,但與COX基因敲除小鼠胃炎的加重?zé)o關(guān).第2部分重組減毒沙門疫苗菌對幽門螺桿菌感染防治的動物實驗研究研究背景和目的幽門螺桿菌的致病是個復(fù)

9、雜的多步驟多因素過程.Hp誘導(dǎo)的特異性抗體和細胞免疫不能有效地清除細菌,反而可導(dǎo)致胃粘膜免疫病理損害.有效的預(yù)防和治療Hp感染的方法將有可能大幅度降低上述消化道疾病的發(fā)病率.目前常用的聯(lián)合化學(xué)藥物治療雖然有高達90%的Hp根除率,但有一定的副反應(yīng)、價格昂貴、抗生素耐藥率逐年增高及病人的依從性差等缺點.采用人體可很好耐受、效高價廉的Hp疫苗預(yù)防和治療Hp感染是一個較為理想的方法,具有很好的社會和經(jīng)濟效益.方法1.重組減毒沙門疫苗菌的免疫和

10、治療免疫方法:將Ⅱ級C57BL/6小鼠隨機分生理鹽水組、PBS組、減毒鼠傷寒沙門菌SL3261組、重組減毒鼠傷寒沙門菌pTrc99A-ureB+pGSTag-katA組、重組減毒鼠傷寒沙門菌pTrc99A-ureB+pTrc99A-hpaA組及重組減毒鼠傷寒沙門菌pTrc99A-ureB+pGSTag-katA+pTrc99A-hpaA組,共6組,每組10~12只.通過灌胃方法進行口服免疫.免疫4周后,再通過灌胃方法每只小鼠(生理鹽水組

11、除外)均用活力良好的Hp菌株攻擊2次(1×10<'7>CFU/只),每日1次.再4周后處死所有小鼠.治療方法:將Ⅱ級C57BL/6小鼠隨機分為重組減毒沙門菌尿素酶B亞單位疫苗組、過氧化氫酶疫苗組和生理鹽水組3組,每組1O只.通過灌胃方法每只小鼠均用活力良好的Hp菌株攻擊2次(1×10<'7>CFU/只),隔日1次.在攻擊后的4周,相應(yīng)組分別給予予重組減毒沙門菌尿素酶B亞單位疫苗(1×10<'7>CFU/只)、重組減毒沙門菌過氧化氫酶疫苗

12、(1×10<'7>CFU/只)灌胃治療及生理鹽水灌胃(對照組).治療后4周處死所有小鼠.2.鼠胃幽門螺桿菌檢查小鼠經(jīng)處死后,取出胃縱行切為兩半.其中一半作定量細菌培養(yǎng);另一半再縱行一分為二,一半用于快速尿素酶試驗,另一半用中性福爾馬林固定,用石蠟包埋后切片行改良Giemsa染色和H&E染色,分別用于觀察Hp定植和粘膜炎癥情況.3.定量培養(yǎng)細菌將一半鼠胃稱重后勻漿,再將勻漿作1:10、1:100、1:1000系列倍比稀釋,取每一稀釋度勻漿

13、100μl接種于改良Skirrow選擇性瓊脂平板上,于37℃微需氧條件下培養(yǎng)3天,計數(shù)Hp菌落數(shù).4.抗原特異性淋巴細胞增殖反應(yīng)的測定處死小鼠后,取脾制備細胞懸液.調(diào)整細胞濃度,并按四甲基偶氮唑鹽(MTT)法完成相關(guān)步驟.增殖指數(shù)=實驗組OD值/對照組OD值.結(jié)論1.口服表達Hp-ureB、katA和hpaA的多組分重組減毒沙門疫苗菌對小鼠Hp感染具有一定免疫保護作用,但不能完全預(yù)防感染,需進一步篩選更為有效的抗原,構(gòu)建更為合理的多組分