幽門螺桿菌Cag致病島hp0540基因在其致病機(jī)制中的作用.pdf

1、目的：構(gòu)建幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,H.pylori)Cag致病島中hp0540基因的原核表達(dá)系統(tǒng)及其缺失株，初步探討其在CagA轉(zhuǎn)運(yùn)過程中的作用，為深入研究其在H.pylori致病機(jī)制中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1.應(yīng)用PCR技術(shù)從H.pylori11637基因組DNA中擴(kuò)增hp0540基因片段，克隆至pMD18-2T載體后，進(jìn)行序列測定，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；
　　

2、 2.構(gòu)建pET-28a-hp0540原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌BL21DE3；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE法鑒定目的蛋白的表達(dá)，并以Ni2+-NTA柱分離純化目的蛋白；將純化蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體并測定抗體效價；
　　 3.利用同源重組原理，設(shè)計(jì)引物并擴(kuò)增hp0540基因上下游同源臂片段，構(gòu)建hp0540基因缺失自殺質(zhì)粒pBlueKM402△hp0540，電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)入幽門螺桿菌，通過抗生素平板進(jìn)行傳代

3、篩選，通過PCR方法驗(yàn)證hp0540基因缺失株H.pylori11637△hp0540的獲得；
　　 4.將hp0540基因缺失株和野生株與正常胃上皮細(xì)胞GES-1進(jìn)行共培養(yǎng)，然后采用Western blot的方法檢測H.pylori轉(zhuǎn)運(yùn)CagA蛋白能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功克隆了hp0540基因，全長1086bp(GenBank登錄號為HM126476)，編碼361個氨基酸，與GenBank公布

4、的其他H.pylori菌株基因序列的核苷酸同源性為98％。DNAStar軟件預(yù)測其編碼的蛋白質(zhì)的相對分子量為39.37kDa，具有較強(qiáng)的免疫原性。
　　 2.成功構(gòu)建了pET-28a-hp0540原核表達(dá)載體，工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE顯示新生表達(dá)蛋白條帶，相對分子質(zhì)量約為39kDa，經(jīng)Ni2+-NTA柱純化后可獲得重組蛋白，重組蛋白免疫新西蘭大白兔后獲得效價為1:1.6×105的多克隆抗體。
　　 3.成

5、功構(gòu)建了幽門螺桿菌hp0540基因缺失的自殺質(zhì)粒pBlueKM402△hp0540，并篩選獲得了hp0540基因的缺失株。
　　 4.將野生株與hp0540缺失株分別與正常胃上皮細(xì)胞GES-1共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)hp0540基因缺失株處理組中胃上皮細(xì)胞內(nèi)檢測到的CagA蛋白要明顯弱于野生株。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了hp0540基因的原核表達(dá)系統(tǒng)及其缺失株，在與正常胃上皮細(xì)胞GES-1的共培養(yǎng)中，hp0540的缺失可以減弱Cag