DNA自組裝納米結(jié)構(gòu)在生物傳感中的應(yīng)用.pdf

1、沃森(Watson)和克里克(Crick)在1953年發(fā)現(xiàn)了DNA堿基配對原則和雙螺旋結(jié)構(gòu)，自此以后，分子生物學(xué)得到了飛速發(fā)展。由于DNA分子具有小巧堅固的結(jié)構(gòu)，高信息量存儲和特異性的堿基配對特點，使得其可以作為分子建筑模塊來構(gòu)建功能化的納米材料和器件。上世紀八十年代，紐約大學(xué)的Nadrian C.Seeman教授開創(chuàng)了DNA納米自組裝技術(shù)，該技術(shù)利用DNA分子作為組裝模塊材料，通過自下至上的方式，組裝出了許多有確定幾何結(jié)構(gòu)的納米級物體

2、。隨后，在過去的三十年里，一系列可尋址的一維，二維以及三維的DNA納米結(jié)構(gòu)接連創(chuàng)造了出來，然而，發(fā)展具有功能性的確定幾何外形的DNA納米結(jié)構(gòu)卻是一個亟待解決的問題。
　　現(xiàn)階段報道的DNA納米結(jié)構(gòu)僅處于模型階段，而它的生物應(yīng)用還處于萌芽階段，本論文基于DNA自組裝形成的新型納米結(jié)構(gòu)并運用于生物傳感，開發(fā)出了低成本、操作簡便以及高靈敏的新型納米生物傳感器。
　　1. RNA調(diào)控的分子鉗子靈敏檢測癌細胞中microRNA

3、　　基于DNA鉗子納米探針，本文構(gòu)建了一種免酶且高選擇性的生物傳感器用于前列腺癌細胞中microRNA(miR-141)的檢測。我們用非變性凝膠電泳表征了自組裝形成的DNA鉗子的調(diào)控能力。當加入燃料鏈，即目標物microRNA的時候，鉗子機器裝置迫使被關(guān)閉，導(dǎo)致熒光淬滅。當加入抗燃料鏈時，目標物被置換出來，并釋放出支架鏈，鉗子機器重新回到打開的狀態(tài)熒光恢復(fù)。體系中只要交替的加入目標鏈和抗燃料鏈，該裝置就會循環(huán)往復(fù)的進行打開/關(guān)閉的操作。

4、目標物miR-141對DNA鉗子納米機器的調(diào)控能力與其濃度成線性關(guān)系，因此，能夠用于檢測miR-141，檢測限可低至0.6pmol.L-1。體系中設(shè)計操作的DNA鉗子納米機器是基于toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，具有很強的特異性，能夠在成分復(fù)雜的細胞裂解液中檢測出目標物。
　　2.MicroRNA誘導(dǎo)催化自組裝DNA納米結(jié)構(gòu)靈敏檢測癌細胞中microRNA
　　通過聯(lián)合雜交鏈式反應(yīng)(HCR)和T-連接內(nèi)聚(T-junctio

5、n cohesion)自組裝方式，我們成功的組裝出一個具有36±8nm的DNA納米輪，組裝過程中設(shè)計的toehold介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)，使得目標物miR-141得以循環(huán)使用，從而實現(xiàn)了從腫瘤細胞中超靈敏的檢測miR-141，檢測限達到261個細胞。本體系中，避免了使用酶和制備復(fù)雜的納米材料，穩(wěn)定性得到了很大的提升，和傳統(tǒng)報道的基于DNA折紙自組裝方式不同的是，實驗過程中僅僅涉及到四條DNA鏈，避免了復(fù)雜且耗時的DNA鏈設(shè)計過程，同時也節(jié)約

6、了實驗成本。DNA自組裝形成的納米輪具有高的選擇性，能夠?qū)崿F(xiàn)單堿基錯配檢測，因此能夠運用于不同的生物標志物的檢測。
　　3.末端保護的小分子鏈接的ssDNA用于游離且靈敏的比色法檢測葉酸受體
　　小分子/蛋白之間的特異性作用在藥物研發(fā)，醫(yī)學(xué)臨床診斷，生物蛋白代謝之間的相互作用起著至關(guān)重要的作用。利用葉酸(FA)和葉酸受體(FR)之間的特異性結(jié)合性質(zhì)，此體系設(shè)計了一種便捷高效且靈敏的比色生物傳感器用于檢測生物標志物，葉酸受體蛋

7、白。傳感器的設(shè)計原理是依靠末端保護的FA連接的單鏈DNA(ssDNA)引發(fā)自組裝形成的DNAzyme聚合物進行信號放大檢測。目標蛋白FR通過特異性結(jié)合作用與連接在ssDNA上的FA結(jié)合，結(jié)合FR的FA-ssDNA探針能抵制Exo I的水解。受到保護的單鏈DNA能引發(fā)兩個包含G四倍體序列的發(fā)夾DNA自組裝形成DNAzyme聚合物，從而使得溶液的顏色發(fā)生顯著的變化達到免標記且靈敏的比色檢測FR的目的。通過聚丙烯凝膠電泳我們證明了末端保護的s

8、sDNA觸發(fā)自組裝形成的DNAzyme聚合物，對實驗參數(shù)也進行了優(yōu)化。在最優(yōu)實驗條件下，能用紫外吸收光譜儀檢測到0.35pmol.L-1的FR，而能用肉眼直接檢測到5pmol.L-1的FR。研發(fā)的傳感器具有很高的選擇性能在干擾物質(zhì)中特異性識別出目標物，并能在血清樣品中檢測目標物，這使得設(shè)計的末端保護自組裝傳感器能用于檢測不同類型的小分子/蛋白之間的相互作用。
　　4.基于未修飾的適體和DNAzyme用以目標循環(huán)放大檢測ATP

9、>　　基于目標循環(huán)放大的方法，我們利用未修飾的適體和DNAzyme構(gòu)建了一種免標記的，簡單靈敏的比色ATP檢測方法。目標物ATP和雙鏈DNA探針中的適體特異性結(jié)合，導(dǎo)致G四倍體鏈的釋放。ATP結(jié)合適體后被Exo III降解，釋放出目標物ATP，釋放出的ATP可再次與雙鏈DNA探針中的適體鏈相結(jié)合，到達目標循環(huán)放大的目的。由于目標分子的循環(huán)擴增，被釋放的G四倍體序列鏈的量顯著增加。隨后，釋放出的G四倍體鏈與hemin結(jié)合，形成hemin/