DNA納米材料的設(shè)計(jì)及其在生物傳感和蛋白質(zhì)機(jī)器中的應(yīng)用.pdf

1、DNA不僅是遺傳信息的載體，同時(shí)還具有識(shí)別、催化和“建筑”等諸多功能，因而在生物傳感、藥物運(yùn)輸、蛋白質(zhì)機(jī)器、納米光子學(xué)等領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，隨著研究的深入，研究者們也遇到了一些新的挑戰(zhàn)。其中，DNA納米材料在生物傳感和蛋白質(zhì)機(jī)器方面的應(yīng)用受到了以下限制:
　　分子信標(biāo)、核酸適體等DNA納米材料在生物傳感器的設(shè)計(jì)方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，因此得到了廣泛的應(yīng)用，但是仍然存在以下問題:(1) DNA納米材料在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性。細(xì)胞內(nèi)含

2、有核酸外切酶、核酸內(nèi)切酶等各種各樣的核酸酶，且數(shù)量巨大，容易將具有生物傳感或藥物運(yùn)輸?shù)忍囟üδ艿腄NA納米材料降解而導(dǎo)致其功能失效;(2) DNA納米材料在細(xì)胞上的定位能力。細(xì)胞是由細(xì)胞核、線粒體、溶酶體、細(xì)胞膜等細(xì)胞器組成的，且不同細(xì)胞器的功能也各不一樣。要真正實(shí)現(xiàn)DNA納米材料在細(xì)胞上的生物傳感、生物成像和藥物運(yùn)輸?shù)葢?yīng)用，需要保證這些材料能夠特異性地定位在目標(biāo)位置上。
　　蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)或其他分子形成的低維度復(fù)合物是一類特殊的

3、蛋白質(zhì)機(jī)器。實(shí)現(xiàn)特定的蛋白質(zhì)機(jī)器的構(gòu)建有利于人們深入理解生命現(xiàn)象的本質(zhì)并將其運(yùn)用于人類社會(huì)。目前，基于DNA納米材料的蛋白質(zhì)機(jī)器的構(gòu)筑已經(jīng)見諸報(bào)道，但是仍存在以下不足:(1)復(fù)雜的多酶體系的精確組裝。一些基于雙鏈DNA和DNA小單元的納米結(jié)構(gòu)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)簡(jiǎn)單的多酶體系的構(gòu)建，但是存在著剛性不足、容易彎曲、變化較少、無法滿足較大距離的調(diào)控或復(fù)雜的二維圖案的排布等不足之處。此外，科學(xué)家們?nèi)孕鑼⒀芯客卣沟矫妇W(wǎng)絡(luò)更復(fù)雜、組分種類更多（比如包括輔

4、酶因子）的多酶體系的構(gòu)建，以滿足生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用要求;(2)多酶體系功能的動(dòng)態(tài)調(diào)控。當(dāng)前的研究主要集中在靜態(tài)多酶體系的構(gòu)建，而對(duì)于蛋白質(zhì)機(jī)器的動(dòng)態(tài)研究較少。實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)機(jī)器的智能、定向、高效的動(dòng)態(tài)調(diào)控具有重要意義。
　　為了解決以上問題，本論文從以下幾個(gè)方面展開研究:
　　一、利用L-DNA構(gòu)建分子信標(biāo)，提高DNA探針在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性
　　為了提高探針在細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性并排除生物大分子非特異性結(jié)合引起的干擾，我們發(fā)展了一種基

5、于L-DNA的分子信標(biāo)，并將其應(yīng)用于細(xì)胞溫度的傳感。L-DNA是與天然堿基D-DNA鏡像互補(bǔ)的異構(gòu)體。它不被天然核酸酶降解，因此在細(xì)胞內(nèi)具有非常好的生物穩(wěn)定性。此外，L-DNA不與天然核酸和蛋白結(jié)合，能夠有效避免細(xì)胞內(nèi)生物大分子的非特異性結(jié)合。因此，我們?cè)O(shè)計(jì)的L-DNA構(gòu)成的分子信標(biāo)，具有良好的生物穩(wěn)定性和抗干擾能力。由于分子信標(biāo)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)對(duì)溫度非常敏感，它在低溫時(shí)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)導(dǎo)致熒光淬滅，而在高溫時(shí)發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開引起熒光信號(hào)的增強(qiáng)，因此

6、能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞溫度的靈敏傳感。最后，我們成功地將基于L-DNA分子信標(biāo)的納米溫度計(jì)應(yīng)用于細(xì)胞內(nèi)鈀納米片的光熱效應(yīng)研究，展現(xiàn)了它在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域良好的應(yīng)用潛力。
　　二、將DNA探針磷脂化修飾，提高DNA探針在細(xì)胞上的定位能力
　　為了解決DNA探針空間定位能力差、較難實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜上的傳感的問題，我們將一段疏水的磷脂片段修飾在DNA探針上，使其成為兩親分子并通過疏水相互作用固定在細(xì)胞膜表面，從而發(fā)展了一種適用于細(xì)胞膜表面?zhèn)鞲械姆椒ā?/p>

7、我們?cè)趦捎HDNA探針上同時(shí)修飾pH敏感的綠色熒光染料FAM作為pH的熒光指示劑和pH不敏感的紅色熒光染料TAMRA作為內(nèi)標(biāo)，從而發(fā)展了一種胞外pH的比率型熒光傳感器。該傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)6.0-8.0范圍內(nèi)pH的靈敏響應(yīng)，并成功應(yīng)用于細(xì)胞三維培養(yǎng)環(huán)境中pH的傳感。
　　三、以DNA納米結(jié)構(gòu)為模板，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的人工多酶體系的精確組裝
　　為了提高人工多酶體系的構(gòu)建精度，我們以DNA折紙術(shù)（DNA origami）形成的納米結(jié)構(gòu)為模板

8、介導(dǎo)酶和輔酶因子的組裝。DNA origami是通過一段長(zhǎng)序列的模板DNA單鏈和經(jīng)過軟件設(shè)計(jì)的上百條短鏈DNA的自組裝形成的，具有優(yōu)異的可尋址性和納米級(jí)的空間分辨率。根據(jù)這些特性，我們以DNA origami為模板，通過模板上的捕獲探針與蛋白或輔酶因子上的DNA探針的雜交，成功地構(gòu)建了一種由三種脫氫酶和一種輔酶因子組成的多酶體系。
　　四、利用動(dòng)態(tài)DNA技術(shù)，實(shí)現(xiàn)酶通道的定向調(diào)控
　　為了實(shí)現(xiàn)酶通道的定向調(diào)控，我們?cè)诨贒N

9、A origami的人工多酶體系上，利用動(dòng)態(tài)DNA組裝技術(shù)特異性地調(diào)控輔酶因子的位置，從而實(shí)現(xiàn)相應(yīng)酶通道的開啟和關(guān)閉。由輔酶因子-DNA復(fù)合物構(gòu)成的底物通道(substrate channeling)能夠在級(jí)聯(lián)酶之間直接傳遞中間代謝產(chǎn)物從而激活酶通道，因此其位置對(duì)于酶通道的活性具有重要的影響。利用這個(gè)原理，我們?cè)贒NA origami上設(shè)計(jì)了一種智能的底物通道載體，使其能夠在特定的DNA“開關(guān)”的存在下將底物通道運(yùn)輸至特定位點(diǎn)，從而定向