陽離子配體修飾的納米金用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和微囊自組裝研究.pdf

1、納米金(AuNPs)具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，其物理性質(zhì)主要表現(xiàn)為表面等離子體共振吸收、增強(qiáng)磁共振、表面增強(qiáng)拉曼散射以及熒光增強(qiáng)和淬滅；其化學(xué)性質(zhì)主要包括抗氧化性、生物惰性、低細(xì)胞毒性以及容易通過Au-s共價(jià)結(jié)合含有巰基的配體。用含有巰基的功能性配體對(duì)AuNPs進(jìn)行表面修飾，可以整合AuNPs的物理和化學(xué)性質(zhì)以及修飾配體的特殊功能，賦予AuNPs全新的化學(xué)和生物功能，使其能夠應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)運(yùn)、生物傳感、生物成像和疾病治療等研究領(lǐng)域。本文設(shè)

2、計(jì)并合成了多種含有巰基的陽離子配體，通過配體交換法用這些陽離子配體對(duì)AuNPs進(jìn)行表面修飾，制備了多種表面帶有正電荷且具有特殊化學(xué)和生物功能的AuNPs，利用這些AuNPs的化學(xué)和生物功能，將其分別應(yīng)用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和微囊自組裝研究。
　　 ①陽離子多肽配體修飾的AuNPs用于基因轉(zhuǎn)運(yùn)研究.用多肽的固相合成法制備了四種陽離子短鏈多肽RRR、KKK、KRK和HKRK，將其連接到巰基化合物上后分別用于AuNPs的表面修飾，得到表面帶有正

3、電荷的RRR-AuNPs、KKK-AuNPs、KRK-AuNPs和HKRK-AuNPs，其中RRR-AuNPs在水溶液中分散性差，其它三種納米粒子可以穩(wěn)定的分散于水溶液中。將三種在水溶液中具有良好分散性的AuNPs作為基因轉(zhuǎn)運(yùn)載體，以β-半乳糖苷酶(β-gal)作為報(bào)告基因，293T細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)運(yùn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：三種AuNPs均能將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至293T細(xì)胞內(nèi)，并能使報(bào)告基因在細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，其基因轉(zhuǎn)運(yùn)效率依次為HKRK-

4、AuNPs>KRK-AuNPs>KKK-AuNPs；細(xì)胞毒性分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KKK-AuNPs具有微弱的細(xì)胞毒性，HKRK-AuNPs和KRK-AuNPs無明顯細(xì)胞毒性；透射電鏡(TEM)分析結(jié)果表明AuNPs轉(zhuǎn)運(yùn)載體進(jìn)入細(xì)胞的通道為細(xì)胞內(nèi)吞。
　　 ②陽離子多肽配體修飾的AuNPs用于酶的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究。HKRK-AuNPs在基因轉(zhuǎn)運(yùn)中表現(xiàn)出了細(xì)胞轉(zhuǎn)染率高和細(xì)胞毒性低的特點(diǎn)，為深入研究HKRK-AuNPs的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)功能，將其作

5、為蛋白酶β-gal的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，以HeLa、COS-1、C2C12和MCF7四種細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行酶的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HKRK-AuNPs可通過靜電吸附同β-gal結(jié)合，兩者結(jié)合后β-gal的二級(jí)結(jié)構(gòu)不會(huì)發(fā)生明顯改變；HKRK-AuNPs可通過細(xì)胞內(nèi)吞的方式將β-gal轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，并且該納米粒子具有將β-gal從細(xì)胞內(nèi)吞過程中形成的內(nèi)涵體中釋放到細(xì)胞內(nèi)的功能，被轉(zhuǎn)運(yùn)的β-gal在細(xì)胞內(nèi)能保持其原有的生物活性；阿爾馬藍(lán)細(xì)胞活性分析

6、法、臺(tái)盼藍(lán)排除法和鈣黃綠素細(xì)胞活性分析法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示，HKRK-AuNPs在實(shí)驗(yàn)條件下無細(xì)胞毒性，是一種優(yōu)良的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
　　 ③陽離子季胺(TTMA)配體修飾的AuNPs輔助酶自組裝催化微囊。將酶固定在比表面積大的球形載體上可提高酶的固定率和利用率，O/W乳滴是酶固定化的一種理想載體，但由于缺乏強(qiáng)烈的相互作用力，酶不能直接吸附在乳滴表面。用TTMA配體對(duì)AuNPs進(jìn)行表面修飾，得到表面帶有正電荷的TTMA-AuNPs

7、，將其同帶負(fù)電荷的β-gal通過靜電吸附結(jié)合形成TTMA-AuNPs/β-gal復(fù)合物，用該復(fù)合物進(jìn)行O/W乳滴界面的自組裝研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：單獨(dú)的TTMA-AuNPs或β-gal不能在乳滴界面進(jìn)行自組裝，但TTMA-AuNPs/β-gal復(fù)合物卻可以在乳滴界面自組裝形成穩(wěn)定的微囊；比較TTMA-AuNPs、β-gal和TTMA-AuNPs/β-gal復(fù)合物的表面電荷密度后發(fā)現(xiàn)，TTMA-AuNPs和β-gal的表面電荷密度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于TTM

8、A-AuNPs/β-gal復(fù)合物，電荷密度降低是TTMA-AuNPs/β-gal復(fù)合物在乳滴界面發(fā)生自組裝的主要驅(qū)動(dòng)力；這種新型的自組裝方法可將溶液中99％以上的β-gal固定到乳滴表面，并且β-gal固定到乳滴表面后其生物活性可保留76％。
　　 ④陽離子精氨酸(Arg)配體修飾的AuNPs用于載藥納囊自組裝研究。以納米粒子作為囊壁的微囊在藥物轉(zhuǎn)運(yùn)研究領(lǐng)域有潛在應(yīng)用價(jià)值，但目前的方法只能自組裝粒徑在1～50μm左右的微囊，較大

9、的尺寸限制了該類型微囊在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中的應(yīng)用。納米級(jí)微囊(納囊)自組裝困難的主要原因是納米粒子難以克服納米級(jí)乳滴的界面能和拉普拉斯壓力差，針對(duì)該技術(shù)難點(diǎn)，本文設(shè)計(jì)了一種全新的納囊自組裝方法：首先用陽離子Arg配體對(duì)AuNPs進(jìn)行修飾，得到表面帶有正電荷的Arg-AuNPs，并用亞油酸作為油相制備納米級(jí)O/W乳滴模板；然后將兩者在溶液中混合進(jìn)行自組裝，Arg-AuNPs表面的精氨酸與亞油酸末端的羧基之間形成強(qiáng)烈的氫鍵相互作用，這種超分子作用使

10、納米粒子能夠克服乳滴的界面能和拉普拉斯壓力差，將納米粒子組裝到乳滴表面形成穩(wěn)定的納囊；最后用帶負(fù)電荷的轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)乳滴表面帶正電荷的Arg-AuNPs進(jìn)行交聯(lián)，以進(jìn)一步提高納囊的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Arg-AuNPs在亞油酸乳滴模板界面自組裝釋放出大量界面能，將納米粒子牢固的吸附在乳滴表面；TEM和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析結(jié)果顯示，這種基于超分子作用的方法可自組裝粒徑在～100nm左右的納囊；將自組裝得到的納囊用于抗癌藥物紫杉醇在HeL