自組裝納米載體用于基因輸送的研究.pdf

1、基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑毎?，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達到治療目的。但是，目前基因治療遇到諸多挑戰(zhàn)，其中最大的挑戰(zhàn)是如何獲得高效安全的基因輸送載體?；蜉d體分為病毒載體和非病毒載體。相對于病毒載體，非病毒載體具有安全性能高和可大規(guī)模應用的優(yōu)點，但其基因表達效率低，且體內(nèi)體外基因轉(zhuǎn)染效率不一致。本文的工作目標是制備適于體內(nèi)應用且具有體內(nèi)高轉(zhuǎn)染效率的新型基因輸送體系。
　　 聚乙烯亞胺(PEI)在體外具有

2、高轉(zhuǎn)染效率，已被廣泛用于體外基因輸送。但PEI與DNA形成的復合物(polyplexes)帶正電荷，與血液中蛋白質(zhì)有非特異性相互作用，導致血液濃度半衰期短。在復合物表面通過靜電相互作用包裹一層帶負電的聚合物可以降低這種非特異性作用，但帶負電荷的聚合物會與DNA競爭絡和PEI，導致復合物穩(wěn)定性變差，復合物在血液中就有可能解開。同時，PEI與DNA之間強的靜電相互作用，使他們的復合物在細胞核中不容易解開，因此DNA不容易被表達。
　　

3、 本工作的設計思路是：PEI與DNA復合后通過細胞內(nèi)可斷裂鍵進行高度交聯(lián)，然后包裹聚陰離子聚合物。因此，即使聚陰離子聚合物與PEI作用，DNA也不會被釋放出來；而在細胞內(nèi)，交聯(lián)鍵斷裂后，由于聚陰離子與PEI的競爭絡和，使DNA容易被釋放出來，從而使DNA容易被表達，提高基因轉(zhuǎn)染效率。本論文以PEI為基礎，設計了交聯(lián)的PEI/DNA復合物，并用聚陰離子對PEI/DNA復合物表面進行修飾，形成“三明治”型基因輸送體系，初步探討了它們的體內(nèi)

4、基因輸送的能力。
　　 第一個工作是肝素(HP)包埋的可逆交聯(lián)PEI/DNA復合物作為體內(nèi)靶向基因輸送體系。首先制備了PEI/DNA復合物，并用二硫鍵對該復合物進行交聯(lián)，交聯(lián)后的復合物更加穩(wěn)定。再用肝素包埋該復合物，形成HP/PEI/DNA復合物，其納米粒徑在100nm左右，在血清和高鹽溶液中具有良好的穩(wěn)定性，且細胞毒性低。考察了該基因輸送體系在體內(nèi)腫瘤部位基因轉(zhuǎn)染效率，將帶有EGFP報告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染接種有人源乳腺癌的裸鼠，結(jié)

5、果檢測到裸鼠腫瘤部位高度表達綠色熒光蛋白，并通過免疫組化實驗證實，表明該基因輸送體系具有在體內(nèi)應用的潛力。
　　 第二個工作是用透明質(zhì)酸(HA)包埋的PEI-Dexa/DNA復合物。HA具有良好的“不黏附”性能，阻止復合物的非特異性作用，但它良好的“不黏附”性能也使得復合物很難進入細胞。有些腫瘤細胞高表達HA受體，因此，HA包裹的復合物可通過受體介導的細胞內(nèi)吞進入腫瘤細胞。地塞米松(Dexa)具有核靶向能力，因此引入Dexa到復

6、合物上來可進一步提高其入核能力。因此，制備了HA包埋的PEI-Dexa/DNA復合物。首先將Dexa共價連接到PEI(MW25 kDa)鏈上，考察了地塞米松的引入對細胞毒性和細胞轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明，地塞米松修飾后，細胞毒性有所降低但轉(zhuǎn)染效率可能由于Dexa的屏蔽作用較PEI(MW25 kDa)略降低。其次，用透明質(zhì)酸包埋形成的HA/PEI-Dexa/DNA復合物對高表達HA受體的細胞株的轉(zhuǎn)染效率高于HA受體陰性的細胞株，表明HA的

7、引入對HA受體陽性的細胞的轉(zhuǎn)染具有促進作用。
　　 第三種是用陰離子脂質(zhì)體包埋PEI/DNA復合物。本工作目的是初步探討利用脂質(zhì)體與細胞膜融合的能力制備模擬病毒體的基因輸送體系。初步制備了陰離子脂質(zhì)體包埋的Lipid/PEI/DNA復合物，發(fā)現(xiàn)顆粒表面攜帶負電荷，具有體內(nèi)應用的潛力，但由于該基因輸送體系表面帶強的負電性，即使加入靶向基團葉酸，在細胞水平的轉(zhuǎn)染效率仍然很低。因此，還需對陰離子脂質(zhì)體的種類等進行優(yōu)化，以獲得轉(zhuǎn)染效率高