自組裝納米載體用于基因輸送的研究.pdf

1、基因治療是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，從而達(dá)到治療目的。但是，目前基因治療遇到諸多挑戰(zhàn)，其中最大的挑戰(zhàn)是如何獲得高效安全的基因輸送載體。基因載體分為病毒載體和非病毒載體。相對(duì)于病毒載體，非病毒載體具有安全性能高和可大規(guī)模應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)，但其基因表達(dá)效率低，且體內(nèi)體外基因轉(zhuǎn)染效率不一致。本文的工作目標(biāo)是制備適于體內(nèi)應(yīng)用且具有體內(nèi)高轉(zhuǎn)染效率的新型基因輸送體系。
　　 聚乙烯亞胺(PEI)在體外具有

2、高轉(zhuǎn)染效率，已被廣泛用于體外基因輸送。但PEI與DNA形成的復(fù)合物(polyplexes)帶正電荷，與血液中蛋白質(zhì)有非特異性相互作用，導(dǎo)致血液濃度半衰期短。在復(fù)合物表面通過(guò)靜電相互作用包裹一層帶負(fù)電的聚合物可以降低這種非特異性作用，但帶負(fù)電荷的聚合物會(huì)與DNA競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)和PEI，導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性變差，復(fù)合物在血液中就有可能解開(kāi)。同時(shí)，PEI與DNA之間強(qiáng)的靜電相互作用，使他們的復(fù)合物在細(xì)胞核中不容易解開(kāi)，因此DNA不容易被表達(dá)。
　　

3、 本工作的設(shè)計(jì)思路是：PEI與DNA復(fù)合后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)可斷裂鍵進(jìn)行高度交聯(lián)，然后包裹聚陰離子聚合物。因此，即使聚陰離子聚合物與PEI作用，DNA也不會(huì)被釋放出來(lái)；而在細(xì)胞內(nèi)，交聯(lián)鍵斷裂后，由于聚陰離子與PEI的競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)和，使DNA容易被釋放出來(lái)，從而使DNA容易被表達(dá)，提高基因轉(zhuǎn)染效率。本論文以PEI為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了交聯(lián)的PEI/DNA復(fù)合物，并用聚陰離子對(duì)PEI/DNA復(fù)合物表面進(jìn)行修飾，形成“三明治”型基因輸送體系，初步探討了它們的體內(nèi)

4、基因輸送的能力。
　　 第一個(gè)工作是肝素(HP)包埋的可逆交聯(lián)PEI/DNA復(fù)合物作為體內(nèi)靶向基因輸送體系。首先制備了PEI/DNA復(fù)合物，并用二硫鍵對(duì)該復(fù)合物進(jìn)行交聯(lián)，交聯(lián)后的復(fù)合物更加穩(wěn)定。再用肝素包埋該復(fù)合物，形成HP/PEI/DNA復(fù)合物，其納米粒徑在100nm左右，在血清和高鹽溶液中具有良好的穩(wěn)定性，且細(xì)胞毒性低?？疾炝嗽摶蜉斔腕w系在體內(nèi)腫瘤部位基因轉(zhuǎn)染效率，將帶有EGFP報(bào)告基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染接種有人源乳腺癌的裸鼠，結(jié)

5、果檢測(cè)到裸鼠腫瘤部位高度表達(dá)綠色熒光蛋白，并通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表明該基因輸送體系具有在體內(nèi)應(yīng)用的潛力。
　　 第二個(gè)工作是用透明質(zhì)酸(HA)包埋的PEI-Dexa/DNA復(fù)合物。HA具有良好的“不黏附”性能，阻止復(fù)合物的非特異性作用，但它良好的“不黏附”性能也使得復(fù)合物很難進(jìn)入細(xì)胞。有些腫瘤細(xì)胞高表達(dá)HA受體，因此，HA包裹的復(fù)合物可通過(guò)受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞。地塞米松(Dexa)具有核靶向能力，因此引入Dexa到復(fù)

6、合物上來(lái)可進(jìn)一步提高其入核能力。因此，制備了HA包埋的PEI-Dexa/DNA復(fù)合物。首先將Dexa共價(jià)連接到PEI(MW25 kDa)鏈上，考察了地塞米松的引入對(duì)細(xì)胞毒性和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的影響。結(jié)果表明，地塞米松修飾后，細(xì)胞毒性有所降低但轉(zhuǎn)染效率可能由于Dexa的屏蔽作用較PEI(MW25 kDa)略降低。其次，用透明質(zhì)酸包埋形成的HA/PEI-Dexa/DNA復(fù)合物對(duì)高表達(dá)HA受體的細(xì)胞株的轉(zhuǎn)染效率高于HA受體陰性的細(xì)胞株，表明HA的

7、引入對(duì)HA受體陽(yáng)性的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染具有促進(jìn)作用。
　　 第三種是用陰離子脂質(zhì)體包埋PEI/DNA復(fù)合物。本工作目的是初步探討利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合的能力制備模擬病毒體的基因輸送體系。初步制備了陰離子脂質(zhì)體包埋的Lipid/PEI/DNA復(fù)合物，發(fā)現(xiàn)顆粒表面攜帶負(fù)電荷，具有體內(nèi)應(yīng)用的潛力，但由于該基因輸送體系表面帶強(qiáng)的負(fù)電性，即使加入靶向基團(tuán)葉酸，在細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)染效率仍然很低。因此，還需對(duì)陰離子脂質(zhì)體的種類(lèi)等進(jìn)行優(yōu)化，以獲得轉(zhuǎn)染效率高