煙草果膠生物降解及應(yīng)用技術(shù)研究.pdf

1、果膠質(zhì)是煙草等植物細胞壁的構(gòu)成成分，是結(jié)構(gòu)復(fù)雜分子量大的復(fù)合糖類化合物。果膠在煙草中的含量約為5％-13%。煙草中果膠質(zhì)含量過高使得煙草燃燒不充分，分解成小分子甲醇、乙酸等使卷煙吸味刺激性大。本課題利用從煙田土壤中自行篩選的產(chǎn)果膠酶的微生物來降解煙草薄片制造工序中的果膠質(zhì)，首先對微生物產(chǎn)酶條件與降解條件進行了優(yōu)化，并分別對果膠質(zhì)酶解后的理化性質(zhì)與酶純化、酶特性進行研究，最后以畢赤酵母為表達載體建立聚半乳糖醛酸酶(PG)基因工程菌，并大規(guī)

2、模施加于薄片制備工藝過程中，從而減少薄片中的果膠質(zhì)含量。本研究為果膠酶工業(yè)化應(yīng)用于薄片制造工藝提供了依據(jù)。
　　研究通過透明圈初篩與搖瓶復(fù)篩法篩選出兩株高產(chǎn)果膠酶的真菌，分別命名為sw06和sw09，經(jīng) ITS序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析鑒定為黑曲霉與微紫青霉。以發(fā)酵罐培養(yǎng)，確定最佳培養(yǎng)周期分別為48h與72h。采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑曲霉(Aspergillus niger) sw06最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：果糖48.90g/L，蛋白胨5.00

3、g/L，果膠粉6.00g/L。此條件下，酶活力理論上可達4198.45U/mL，驗證實驗檢測值為(4175.65±21)U/mL，與初始發(fā)酵培養(yǎng)基相比，酶活力提高1.6倍；采用正交試驗方案設(shè)計優(yōu)化微紫青霉(Penicillium janthinellum)sw09最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：葡萄糖50g/L，酵母浸粉3g/L，KH2PO41g/L，果膠粉2g/L。其中碳源及誘導(dǎo)底物對酶活力影響極顯著。
　　粗果膠酶通過硫酸銨沉淀、Seph

4、arose CL-6B分子篩柱層析以及DEAE-Sepharose FF離子交換柱層析三次分離純化，得到果膠酶的主要組分（經(jīng)鑒定為PG），結(jié)果表明：黑曲霉產(chǎn)果膠酶單一組分分子質(zhì)量為66.2kD。果膠粗酶最適pH值為5.0，最佳反應(yīng)溫度為55℃。pH穩(wěn)定范圍為3.0～5.0，仍保持90%以上酶活力。酶的熱穩(wěn)定性為50℃以下，2h以后仍能保持56.7%酶活，溫度升高，酶的熱穩(wěn)定性下降。酶促反應(yīng)動力學(xué)符合米氏雙曲線方程，米氏常數(shù)Km=(0.5

5、0±0.01)mg/mL，最大反應(yīng)速率Vmax=(5000.00±0.02)μg/(mL·min)。微紫青霉產(chǎn)果膠酶單一組分分子質(zhì)量為66.2kD。粗酶最適pH值為5.0，最佳反應(yīng)溫度為45℃。pH穩(wěn)定范圍為4.0～6.0，酶的熱穩(wěn)定性為50℃以下。酶促反應(yīng)動力學(xué)符合米氏雙曲線方程，米氏常數(shù)Km=(1.67±0.03)mg/mL，最大反應(yīng)速率Vmax=(3333.33±0.02)μg/(mL·min)。
　　分別以二級解纖純梗、二

6、號擠干機出口梗末、高濃混合漿三個試驗點為考察對象，測定以不同條件下的粗酶液降解三個試驗點的果膠降解率。實驗結(jié)果顯示，以微紫青霉產(chǎn)出的粗酶液酶解二級解纖純梗降解效果最好，在料液比1:5、反應(yīng)溫度50℃、處理時間2h的條件下，果膠質(zhì)含量從3.07%下降到1.81%，降解率達到41.35%。
　　分別以最優(yōu)酶解條件下酶解二級解纖純梗，再提取酶解前后二級解纖純梗中的果膠質(zhì)，由紅外光譜分析可以看出，解纖梗中果膠多糖分子主鏈為α-糖苷鍵連接，

7、酶解前后其基本結(jié)構(gòu)官能團并未發(fā)生明顯改變。由GC-MS單糖組分分析可知，果膠質(zhì)基本結(jié)構(gòu)多以半乳糖醛酸單體形式存在，葡萄糖含量其次，成分的組成、含量因酶解發(fā)生了明顯的變化，原解纖梗果膠中半乳糖醛酸含量為39.89%，經(jīng)黑曲霉酶解后降低至19.71%，青霉酶解后降低至28.08%，說明部分果膠已降解。凝膠過濾法測定表明，果膠質(zhì)經(jīng)微紫青霉酶解后，相對分子量由341KDa降低至55KDa。SEC-MALLS測定果膠質(zhì)的絕對分子量，從均方根半徑與

8、重均分子量的雙對數(shù)曲線中判定果膠分子在水溶液中的構(gòu)象。果膠分子主要以球形存在，經(jīng)微紫青霉酶解后，分子形態(tài)出現(xiàn)直鏈型，說明酶促反應(yīng)破壞其球形構(gòu)象打開成直鏈型；重均分子量(Mw)也從3.227×105g/mol減小至7.526×104g/mol，這與凝膠法結(jié)論相符。由熱重分析表明，果膠質(zhì)經(jīng)黑曲霉酶解后，殘重從24.46%下降到9.84%，燃燒更為充分。熱裂解分析可知解纖梗酶解后揮發(fā)性乙酸從(9.07±0.15)%減少到(8.31±0.12)

9、%，氮雜環(huán)類物質(zhì)含量由(5.06±0.03)%降低至(3.97±0.05)%，感官評價表明酶解后的解纖梗添加于卷煙中刺激性減輕，香氣量增加，香氣質(zhì)有所改善，香味更加豐富，但因羰基化合物減少使得勁頭不足。
　　從A.niger sw09中提取聚半乳糖醛酸酶(PG)基因，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pPICZαA，轉(zhuǎn)化畢赤酵母 X33構(gòu)建一株基因工程菌 X33/pPICZαA-PG。轉(zhuǎn)化子基因組片段大小為1608bp。將此基因組片段擴增回收，序列

10、測定表明PG基因已經(jīng)成功地插入畢赤酵母表達載體。陽性克隆蛋白經(jīng)SDS檢測分子量為60KDa左右，可能是由于糖基化的影響，使目的蛋白的分子量比理論值41KDa偏高。重組菌株產(chǎn)酶周期為36h，粗酶活力為2872.91U/mL。融合蛋白經(jīng)過鎳瓊脂糖親和層析法進行純化，經(jīng)檢測為一條清晰帶，重組蛋白質(zhì)濃度測定為8.1μg/μL。在線研究結(jié)果表明，在工藝生產(chǎn)線上的抄造漿中添加重組酵母生產(chǎn)的聚半乳糖醛酸酶降解果膠質(zhì)效果良好，以8‰的添加量為最優(yōu)，抄造