高密度糖基化聚丙烯微孔親和膜的點(diǎn)擊化學(xué)制備及其蛋白質(zhì)分離研究.pdf

1、親和膜色譜是將分離膜與親和色譜相結(jié)合的新型分離技術(shù)，具有膜分離快速對(duì)流傳質(zhì)的特征，通過(guò)配基的選擇可同時(shí)使之兼具生物分子的識(shí)別功能，可一步實(shí)現(xiàn)生物大分子的分離純化。聚丙烯微孔膜具有穩(wěn)定性好、膜孔易調(diào)及成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，是一類(lèi)具有重要工業(yè)化應(yīng)用潛力的高分子分離膜材料。糖類(lèi)可與蛋白質(zhì)發(fā)生特異性識(shí)別作用，且通過(guò)糖苷集簇效應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同蛋白質(zhì)的選擇性識(shí)別。因此，將糖基固定于聚丙烯分離膜表面有望發(fā)展一種新型的親和膜色譜，用于蛋白質(zhì)的高純度、高選擇性及高

2、效快速分離與提純。
　　 文獻(xiàn)報(bào)道的表面糖基化方法種類(lèi)繁多，但所涉及的化學(xué)反應(yīng)效率普遍偏低，造成糖基密度低，不利于糖苷集簇效應(yīng)的形成，從而降低糖基與蛋白質(zhì)問(wèn)的選擇性及結(jié)合強(qiáng)度。發(fā)展一種安全可靠、反應(yīng)效率高的化學(xué)偶聯(lián)技術(shù)是構(gòu)建糖基化親和膜的先決條件。點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)具有反應(yīng)效率高、立體專(zhuān)一性好等優(yōu)點(diǎn)。將點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)用于聚合物膜表面糖基化的構(gòu)建，可方便制得高密度的糖基化層，形成“糖苷集簇效應(yīng)”，提高糖基對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別性能及結(jié)合強(qiáng)度。

3、r>　　 本論文建立了多種糖基化方法，結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)的高效性在聚丙烯微孔膜表面構(gòu)建高密度糖基化層，具體研究工作從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：
　　 1、以二苯甲酮(BP)為引發(fā)劑，采用紫外光輻照接枝聚合方法在聚丙烯微孔膜表面接枝丙烯酸，隨后與2-氨基葡萄糖鹽酸鹽反應(yīng)，制備葡萄糖糖基化的聚丙烯微孔親和膜。優(yōu)化糖基化反應(yīng)條件可提高表面糖基密度，結(jié)果顯示糖基化效率低于40％，糖基密度較低，不能有效形成糖苷集簇效應(yīng)，致使對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別效果較差

4、。
　　 2、為提高表面糖基密度促進(jìn)糖基化親和膜與蛋白質(zhì)形成糖苷集簇效應(yīng)，首先構(gòu)建炔基修飾的聚丙烯微孔膜。采用Cu(Ⅰ)催化的疊氮/炔點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將疊氮糖固定于表面，構(gòu)建高密度的葡萄糖糖基化聚丙烯微孔親和膜，表面糖基密度可超過(guò)10μmol/cm2。蛋白質(zhì)的特異性識(shí)別性能研究顯示，當(dāng)糖基密度超過(guò)0.2μmol/cm2時(shí)，膜表面可產(chǎn)生強(qiáng)烈的糖苷集簇效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)凝集素ConA的特異性識(shí)別。然而點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)生成的三唑環(huán)對(duì)蛋白質(zhì)具有非特異

5、性吸附能力。
　　 3、采用巰/炔點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將炔基修飾的聚丙烯微孔膜進(jìn)行高密度糖基化修飾。通過(guò)蛋白質(zhì)識(shí)別性能研究，證明此方法構(gòu)建的葡萄糖糖基化聚丙烯微孔膜對(duì)ConA具有良好的識(shí)別能力。此外，巰/炔點(diǎn)擊反應(yīng)生成的硫醚鍵可以避免蛋白質(zhì)的非特異性吸附。
　　 4、為避免羧基對(duì)蛋白質(zhì)的非特異性吸附的影響，在表面直接構(gòu)建炔基修飾層。首先合成甲基丙烯酸(三甲基硅基)丙炔醇酯(TMSPA)單體，借助等離子預(yù)處理技術(shù)，在紫外光輻照下進(jìn)

6、行TMSPA的表面接枝聚合。采用巰/炔點(diǎn)擊反應(yīng)在炔基修飾的聚丙烯微孔膜表面構(gòu)建高密度糖基化層。由于巰基糖的空間位阻效應(yīng)導(dǎo)致炔基難以進(jìn)行雙分子加成反應(yīng)，致使點(diǎn)擊反應(yīng)效率最高約為55％。蛋白質(zhì)特異性識(shí)別研究表明葡萄糖糖基化聚丙烯微孔膜對(duì)ConA具有良好的識(shí)別能力。通過(guò)動(dòng)態(tài)吸附研究，初步實(shí)現(xiàn)葡萄糖糖基化聚丙烯親和膜對(duì)ConA的選擇性識(shí)別分離。
　　 5、將疊氮/炔點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建的高密度葡萄糖糖基化聚丙烯微孔膜作為親和分離膜，選擇性動(dòng)