離子液體和聚苯胺納米管修飾絲網(wǎng)印刷DNA生物傳感器的應(yīng)用研究.pdf

1、本研究構(gòu)建了摻雜導(dǎo)電油墨制作的絲網(wǎng)印刷電極，并將其用于對(duì)特定DNA片段和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別和測定，為許多疾病的臨床早期診斷提供基礎(chǔ)性研究。本文著重進(jìn)行了三種類型的DNA傳感器的研制和性質(zhì)研究：
　　 1.絲網(wǎng)印刷電極的構(gòu)建。合成了形貌、尺寸和電導(dǎo)率適當(dāng)?shù)木郾桨芳{米管，然后將室溫離子液體與所合成的聚苯胺納米管共同摻雜入導(dǎo)電油墨中，用于制造三電極絲網(wǎng)印刷DNA傳感器中的工作電極，再用殼聚糖膜加以覆蓋修飾電極。優(yōu)化了摻雜和修飾條件，在最

2、佳條件下所得的電極具有較低的表面阻抗和較高的電化學(xué)靈敏度。
　　 2.基于這個(gè)傳感器建立了一種基于酶放大的DNA夾心檢測的方法。將avidin修飾的辣根過氧化物酶（avidin-HRP）固定到雜交好的DNA上，通過HRP催化底物鄰氨基酚和雙氧水反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)。在實(shí)驗(yàn)選定的最佳條件下，得到了目標(biāo)DNA的線性范圍為8×10-14-2x10-13M，檢測限為8.37x10-15M。另外，三堿基錯(cuò)配序列和完全非互補(bǔ)序列的雜交情況同樣被檢測

3、。其中，三堿基錯(cuò)配序列顯示有微弱的電化學(xué)信號(hào)而完全非互補(bǔ)序列則無信號(hào)檢出。這說明我們設(shè)計(jì)的DNA傳感器具有良好的選擇性。
　　 3.在以上工作的基礎(chǔ)上，我們改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)方法，研究了另一種靈敏度更高的基于六氨基釕和金納米粒子放大信號(hào)的電化學(xué)方法法檢測DNA特定序列的生物傳感器。首先，將巰基修飾的捕獲DNA固定在納米金修飾的絲網(wǎng)印刷電極表面，之后分別與目標(biāo)DNA和標(biāo)記金納米粒子的3’位巰基修飾的檢測探針、探針雜交，形成了“夾心”式的D

4、NA雜交復(fù)合物。通過六氨基釕特異性吸附到納米金結(jié)合的單鏈DNA中，六氨基釕發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生信號(hào)通過計(jì)時(shí)電量法檢測信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)了檢測的靈敏度。結(jié)合以上兩種因素，該DNA傳感器可檢測到10-17的低濃度的目標(biāo)DNA，并在三堿基錯(cuò)配DNA的測定上顯示出良好的選擇性。同時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)的最佳檢測條件進(jìn)行了選擇。在最佳條件下進(jìn)行檢測，得到了目標(biāo)DNA的8×10-17M的檢測限，檢測的線性范圍為1.0×10-16 M到1.0×10-14M。

5、　　 4.我們又深入研究制作了一種可以檢測腫瘤細(xì)胞的傳感器。這種傳感器是以Ramos腫瘤細(xì)胞的適體識(shí)別以及DNA序列的循環(huán)復(fù)制替換為基礎(chǔ)構(gòu)建的。這一檢測方案分兩步進(jìn)行：首先，將適體序列DNA固定在磁珠上后與“信使序列”雜交，Ramos細(xì)胞與這一雜交復(fù)合體結(jié)合導(dǎo)致信使序列DNA釋放出來；將發(fā)卡序列固定在電極上，釋放出的信使序列與其“環(huán)”部分雜交，頸環(huán)部分被打開，再與金納米顆粒結(jié)合的引物DNA雜交形成雜交復(fù)合體，并在DNA復(fù)制酶、脫氧三磷

6、酸核苷酸混合物（dNTP）和鎂離了存在下引發(fā)以引物為起點(diǎn)的DNA聚合反應(yīng)，反應(yīng)過程中形成一條與發(fā)卡探針互補(bǔ)的新鏈，同時(shí)信使序列DNA被替換而釋放到溶液中，找到另一個(gè)發(fā)卡探針開始新的循環(huán)復(fù)制。引物序列上的納米金顆粒同時(shí)附有分子條碼序列，其上吸附有六氨基釘，通過計(jì)時(shí)電量法檢測六氨基釘?shù)难趸€原信號(hào)，進(jìn)一步增強(qiáng)了檢測的靈敏度。結(jié)合以上兩種因素，該DNA傳感器可檢測到10-17的低濃度的目標(biāo)DNA，也可以檢測1 ml溶液中含有100個(gè)細(xì)胞，并在