新型壓電微生物傳感儀及其在臨床分析中的應(yīng)用研究.pdf

1、由微生物感染引發(fā)的疾病已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康。結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌病原體感染引發(fā)的重大傳染性疾病，曾經(jīng)是人類的第一大殺手，隨著抗菌素的廣泛應(yīng)用，上世紀(jì)六七十年代，結(jié)核病的危害直線下降，人類頗有“大獲全勝”的感覺。在上世紀(jì)末，結(jié)核病卻又卷土重來，疫情直線回升，大有重新找回“第一殺手”位置之勢，而最令人擔(dān)心的，莫過于耐藥性結(jié)核病病例的大量出現(xiàn)。 要控制耐藥菌株的發(fā)展，最直接而有效的方法是進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌早期快速檢測。結(jié)核分枝桿菌

2、由于其增代時間長，生長緩慢，比其它微生物更難實現(xiàn)快速檢測。快速全自動微生物培養(yǎng)系統(tǒng)對于臨床病原菌感染的早期診斷、抗生素的合理運(yùn)用、延緩病原菌的耐藥性都起到了十分重要的作用。而目前臨床使用得較多的幾款全自動微生物培養(yǎng)系統(tǒng)包括BACTEC460 TB和BACTEC MGIT960。BACTEC460 TB存在放射性污染、儀器操作和維護(hù)困難。BACTEC MGIT960系統(tǒng)所使用的熒光物質(zhì)易分解造成假陰性。此外，以上儀器本身造價就高，其配套試

3、劑需依賴進(jìn)口，因此其推廣受到經(jīng)濟(jì)條件的限制，對于結(jié)核病發(fā)生率高的貧窮國家或發(fā)展中國家是可望而不可及的。 串聯(lián)式壓電傳感器的主體部分是由壓電石英晶體和一對插入溶液中的平行板金屬對電極串聯(lián)組成，該傳感器對電極問的電參數(shù)變化有靈敏的響應(yīng)。由于其操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏以及價格便宜而深受廣大分析化學(xué)者的歡迎。 本論文在本室前期工作的基礎(chǔ)上，致力于快速、靈敏、準(zhǔn)確而造價便宜的新型串聯(lián)式壓電微生物傳感器的研制。通過改進(jìn)、優(yōu)化或引入新的探

4、頭，解決了傳感器受背景電參數(shù)及電極材料影響的問題，拓寬了該類傳感器在生命科學(xué)中的應(yīng)用，使信息的提取更加準(zhǔn)確容易，測定更加快速方便。鑒于此開展了以下研究工作： (1)新型多通道串聯(lián)式壓電傳感器(MSPQC)的構(gòu)建及其在結(jié)核分枝桿菌減毒菌株H37Ra檢測中的應(yīng)用。該方法是將結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物導(dǎo)致接收液電導(dǎo)變化和串聯(lián)式壓電傳感器對電導(dǎo)的靈敏響應(yīng)結(jié)合起來進(jìn)行檢測。首先，設(shè)計了雙管檢測裝置，外部是檢測管，底部固定有一對電導(dǎo)電

5、極，管內(nèi)盛有2 mlKOH接收溶液；檢測池內(nèi)部是培養(yǎng)管，內(nèi)盛有Youmans改良Proskauer-Beck培養(yǎng)基，結(jié)核分枝桿菌能代謝培養(yǎng)基中甘油和天門冬酰胺產(chǎn)生揮發(fā)性的NH3和CO2，代謝產(chǎn)物能被接收液吸收，導(dǎo)致接收液的電導(dǎo)發(fā)生變化，從而檢測出結(jié)核分枝桿菌。由于雙管結(jié)構(gòu)的引入，解決了檢測受儀器靈敏區(qū)間限制問題。 我們用MSPQC成功地檢測了H37Ra，在102～107cfu·ml-1之間，菌液初始濃度的對數(shù)與檢測時間(FDT)

6、之間存在線性關(guān)系。檢測限為10 cfu·ml-1。同時檢測結(jié)果與全自動化的BACTEC MGIT960進(jìn)行了對比，二者的結(jié)果均通過Ziehl-Neelsen(Z-N)染色法鏡檢證實了H37Ra的存在。該儀器與同類產(chǎn)品相比還有一個最重要的優(yōu)點(diǎn)，價格便宜(儀器約為：10～20萬，試劑約為：20元；而同類產(chǎn)品BACTEC MGIT960儀器：90萬，試劑約為：80元)。MSPQC有望開發(fā)成為一種準(zhǔn)確、快速而廉價的結(jié)核分枝桿菌檢測儀器。

7、 (2)MSPQC用于結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv和臨床菌株的檢測。通過對未減毒標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv與減毒菌株H37Ra在Youmans改良Proskauer-Beck培養(yǎng)基中的MSPQC典型曲線的對比，分析了未減毒菌株可能的代謝途徑，并通過對代謝途徑的推測，優(yōu)化了培養(yǎng)基，獲得了H37Rv的增強(qiáng)檢出信號，初步證實了推測。同時篩查了最佳抑菌劑成分并成功用于臨床菌株的檢測，其檢測結(jié)果與L-J斜面和BACTEC MGIT960進(jìn)行對比，結(jié)果表

8、明，該儀器準(zhǔn)確、快速、簡便，有望應(yīng)用于臨床實驗室結(jié)核分枝桿菌的檢出。 (3)提出MSPQC進(jìn)行一線抗結(jié)核藥物藥敏試驗的新方法。通過設(shè)定參比管，并將參比管加入的菌液濃度調(diào)節(jié)為藥物管濃度的1/100，巧妙地解決了MSPQC的不完全定量問題。根據(jù)臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)機(jī)構(gòu)(CLSI)的規(guī)定成功定義了菌株對于藥物敏感性的快速劃分標(biāo)準(zhǔn)，并在此基礎(chǔ)上將臨床結(jié)核分枝桿菌對異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇和利福平四種一線藥物的敏感性進(jìn)行了實際劃分，其結(jié)果與瓊脂

9、比例法(APM)和BACTEC MGIT960方法進(jìn)行了比較，該法快速、操作簡便，還可以實時監(jiān)測，從而為結(jié)核分枝桿菌藥敏研究及藥物治療提供有效手段。 (4)叉指陣列電極串聯(lián)式壓電傳感器(IDE-SPQC)的構(gòu)建及其在微生物培養(yǎng)檢測中的應(yīng)用。IDE-SPQC是直接將叉指陣列電極(IDE)代替平行板不銹鋼對電極與壓電石英晶體串聯(lián)構(gòu)成。本章通過理論和實驗對比探討了IDE-SPQC與串聯(lián)式壓電傳感器(SPQC)對溶液電導(dǎo)和電容變化的響應(yīng)

10、以及IDE電極參數(shù)對IDE-SPQC響應(yīng)靈敏度的影響。 結(jié)果表明，在一定條件下，IDE-SPQC較SPQC對溶液電參數(shù)的變化有更靈敏的響應(yīng)。當(dāng)使用IDE-SPQC對微生物進(jìn)行檢測時，其線性范圍為10～106 cfu·ml-1，檢測下限為10 cfu·ml-1。其結(jié)果與SPQC和平板計數(shù)法(PPC)進(jìn)行了對比，該方法與SPQC和PPC有相同的準(zhǔn)確度，但較后兩者更快速。 (5)聚苯胺多通道串聯(lián)式壓電傳感器(PAn-MSPQC

11、)的研制。將IDE修飾堿型聚苯胺/聚乙烯醇復(fù)合物制備成PAn探頭與壓電石英晶體串聯(lián)，構(gòu)建了PAn-MSPQC。其用于微生物測定的原理為：細(xì)菌在新陳代謝過程中均會產(chǎn)生CO2，而在一定濕度下CO2能與聚苯胺摻雜，能引起PAn探頭電導(dǎo)的變化，實現(xiàn)對微生物的檢出。相對于SPQC，由于探頭不直接與培養(yǎng)基溶液接觸，該傳感器不受培養(yǎng)基電參數(shù)的影響，不需要特別合成的培養(yǎng)基。利用該傳感器可定量地檢測樣本中的初始微生物濃度，其線性范圍為10～106 cfu

12、·ml-1，其檢測限為10 cfu·ml-1。 (6)聚吡咯多通道串聯(lián)式壓電傳感器的制備(PPY-MSPQC)。常規(guī)的SPQC除了受儀器靈敏區(qū)間限制外，還有一點(diǎn)就是其電極材料難于選擇。導(dǎo)電聚合物經(jīng)摻雜導(dǎo)電率可提高十幾個數(shù)量級，由絕緣體變?yōu)閷?dǎo)體，有金屬性，可作為電極，再加之其對于一些物質(zhì)具有選擇性電響應(yīng)，可將其代替余屬電極作為敏感探頭，與壓電石英晶體串聯(lián)，構(gòu)建新型串聯(lián)式傳感器。 本章以聚吡咯為例，將聚吡咯化學(xué)沉積于絕緣基底

13、上制成導(dǎo)電聚合物膜作為MSPQC的探頭，研究其在高濕度和室溫下對于NH3的響應(yīng)特性。當(dāng)NH3量在0.1μmol到6μmol之間時，氨量與頻移之間存在線性關(guān)系，該方法的最低檢測限為0.1μmol。該傳感器有望用于需在高濕度、室溫下進(jìn)行NH3測量的體系。 (7)PPY-MSPQC用于L-天門冬酰胺酶活性的測定。基于L-天門冬酰胺酶催化L-天門冬酰胺底物水解產(chǎn)生NH3，通過使用PPY-MSPQC測定NH3，從而實現(xiàn)酶活性的測定。使用P