基于壓電傳感的微生物快速檢測(cè)研究.pdf

1、由微生物引起的感染性疾病已嚴(yán)重威脅到人類健康，特別是血流感染導(dǎo)致的高死亡率。微生物的快速準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)降低感染性疾病引起的死亡率至關(guān)重要。目前，全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)如BACTEC產(chǎn)品和BacT/Alert產(chǎn)品已用于臨床微生物的快速準(zhǔn)確檢測(cè)，然而在檢測(cè)過程中，非細(xì)菌性因素引起的CO2增加易引起假陽(yáng)性結(jié)果，BACTEC460存在放射性污染。同時(shí)這些儀器價(jià)格昂貴，使用成本高，增加了患者的醫(yī)療成本，對(duì)于血流感染發(fā)生率高的貧窮國(guó)家及發(fā)展中國(guó)家，難以推

2、廣應(yīng)用，無法滿足更多的臨床需求。研發(fā)一種快速、靈敏、準(zhǔn)確、低成本易于推廣的全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)是目前亟待解決的問題。
　　串聯(lián)式壓電傳感器對(duì)電導(dǎo)電極間的電參數(shù)變化有靈敏的頻率響應(yīng)，由于其具有操作簡(jiǎn)便、成本低、實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，深受研究者歡迎，被廣泛應(yīng)用于分析檢測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域。但其無法實(shí)現(xiàn)微生物的選擇性和多樣本檢測(cè)。論文在前期工作的基礎(chǔ)上，將新材料和新技術(shù)引入到串聯(lián)式壓電傳感器中，充分結(jié)合功能材料、CAN總線控制技術(shù)和串聯(lián)式壓電傳感

3、器的優(yōu)勢(shì)，致力于研發(fā)快速、靈敏、特異的多通道全自動(dòng)壓電微生物傳感檢測(cè)系統(tǒng)。鑒于此，本文主要開展了以下研究工作:
　　1.本文首次構(gòu)建了適配體-單壁碳納米管-叉指金電極壓電(Apt-SWCNT-IDE-SPQC)傳感器用于快速、選擇性地檢測(cè)化膿性鏈球菌。該傳感器利用高特異性結(jié)合化膿性鏈球菌的適配體(Apt)作為識(shí)別探針，靈敏的叉指金電極壓電傳感器(IDE-SPQC)作為檢測(cè)平臺(tái)，具有高比表面積和優(yōu)良導(dǎo)電性的單壁碳納米管(SWCNT)

4、作為交聯(lián)劑及信號(hào)放大因子。實(shí)驗(yàn)利用修飾在SWCNT-IDE-SPQC上的Apt與靶標(biāo)發(fā)生特異性結(jié)合，該過程導(dǎo)致的電極表面電參數(shù)的改變引起傳感器發(fā)生靈敏的頻率變化。該方法可以對(duì)化膿性鏈球菌進(jìn)行定量檢測(cè)，檢測(cè)限低至12 cfu/mL，檢測(cè)在40 min內(nèi)完成。該法具有快速、選擇性高、簡(jiǎn)便、靈敏、成本低等優(yōu)點(diǎn)，有望能應(yīng)用于環(huán)境、食品和臨床中化膿性鏈球菌的快速檢測(cè)及鑒定。
　　2.血培養(yǎng)是臨床診斷血流感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，傳統(tǒng)的手工培養(yǎng)勞動(dòng)強(qiáng)

5、度大、易污染，全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)使血培養(yǎng)更便捷、快速、準(zhǔn)確。但這些進(jìn)口設(shè)備及其耗材價(jià)格較貴，無法普及應(yīng)用。為滿足臨床需求，基于串聯(lián)式壓電傳感器，利用控制器局域網(wǎng)絡(luò)(CAN)技術(shù)研發(fā)了新的可擴(kuò)展的多通道壓電全自動(dòng)血培養(yǎng)儀。此外，為便于用戶使用，對(duì)儀器配套的檢測(cè)軟件也做了改進(jìn)，使新研發(fā)的壓電全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)便、運(yùn)行穩(wěn)定可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本。對(duì)臨床血流感染常見微生物的檢測(cè)結(jié)果與醫(yī)院所用的BacT/ Alert3D結(jié)果一致，靈敏度低至10 c

6、fu/mL。新開發(fā)的壓電全自動(dòng)血培養(yǎng)儀有望降低醫(yī)療成本，促進(jìn)我國(guó)全自動(dòng)血培養(yǎng)儀的發(fā)展和普及應(yīng)用。
　　3.抗生素對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有抑制作用，抗生素的存在是導(dǎo)致血培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率低或檢出時(shí)間延長(zhǎng)的重要原因。所以臨床微生物檢驗(yàn)還要考慮到送檢的樣本中可能含有抗生素的情況。為提高全自動(dòng)壓電血培養(yǎng)儀的陽(yáng)性檢出率和縮短檢出時(shí)間，研發(fā)了混合樹脂用于其配套培養(yǎng)瓶。根據(jù)樹脂吸附效果，篩選出CAD-40、HPD-950和HZ-90樹脂，將其混合，利用正

7、交實(shí)驗(yàn)得到了具有普適性的吸附抗生素的混合樹脂優(yōu)組合(0.20 g CAD-40、0.25 g HPD-950和0.35 g HZ-90)。將該混合樹脂用于壓電全自動(dòng)血培儀配套培養(yǎng)瓶對(duì)模擬血樣進(jìn)行了培養(yǎng)檢測(cè)，與不加樹脂前相比，混合樹脂的引入使壓電系統(tǒng)檢測(cè)含抗生素模擬樣本時(shí)的假陰性結(jié)果全部轉(zhuǎn)為陽(yáng)性結(jié)果。
　　4.為彌補(bǔ)血培養(yǎng)方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)的不足，本文第五章提出將pleurocidin抗菌肽作為識(shí)別探針修飾于SWCNT叉指金電極上，結(jié)合

8、多通道壓電石英晶體(MSPQC)傳感平臺(tái)構(gòu)建了可普適性檢出微生物的新型壓電傳感系統(tǒng)。其檢測(cè)原理是當(dāng)血樣中有微生物存在時(shí)，廣譜pleurocidin抗菌肽與微生物細(xì)胞發(fā)生特殊作用，而從SWCNT-IDE-MSPQC表面脫落，導(dǎo)致修飾電極表面電參數(shù)的改變，引起傳感器靈敏的頻移響應(yīng)。新構(gòu)建的方法成功地檢測(cè)了多種臨床常見菌，檢測(cè)時(shí)間僅需15 min。有望將此法用于臨床微生物引起的感染快速診斷中。
　　5.為了實(shí)現(xiàn)無修飾傳感電極的選擇性檢測(cè)

9、，本文第六章在IDE-MSPQC傳感體系中引入磁珠-Apt-Poly(A)DNA復(fù)合物，用于選擇性檢測(cè)銅綠假單胞菌。其中，磁珠作為載體用于固定銅綠假單胞菌Apt，Apt通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與含Poly(A)的DNA短鏈結(jié)合。當(dāng)檢測(cè)液中存在銅綠假單胞菌時(shí)，菌體與磁珠-Apt-Poly(A)DNA復(fù)合物中的Apt相互作用，使信號(hào)探針Poly(A)DNA鏈從磁珠上脫落進(jìn)入檢測(cè)液。由于Poly(A)與Au之間具有強(qiáng)作用力，檢測(cè)液中的Poly(A)D