生物芯片和納米中藥對肝膽腫瘤早期診治的研究.pdf

1、第一部分生物芯片早期診斷肝膽腫瘤的探討
　　PartⅠMeDIP芯片分析和建立膽管癌差異甲基化譜
　　目的:利用全基因組啟動子區(qū)CpG島甲基化位點檢測芯片技術,分析人膽管癌細胞株與人正常膽管上皮細胞株間的基因甲基化差異,建立膽管癌基因差異甲基化譜,為尋找特異性膽管癌早期診斷標志物奠定。
　　方法:采用NimbleGenHG18CpGPromoter芯片(Roche,Germany)分別檢測人膽管癌細胞株TFK-1和人正

2、常膽管上皮細胞株BEC全基因組啟動子區(qū)CpG島甲基化位點,并分析比較兩細胞株間的差異甲基化位點。并應用MolecularAnnotationSystem(MAS)軟件分析差異甲基化位點對應的基因的功能。采用亞硫酸氫鹽測序法(BSP)檢測HOX基因甲基化水平。采用熒光定量PCR和western-blot法檢測目的基因在細胞水平的表達情況。免疫組化檢測目的基因在膽管癌和癌旁組織中的表達差異。甲基化PCR(MSP)檢測甲基轉移酶抑制劑干預前后

3、,目的基因甲基化的變化情況。
　　結果:1.MeDIP芯片結果顯示:相比于BEC細胞株TFK-1細胞株中有2103個CpG島表現(xiàn)為差異性高甲基化;
　　2.在所有差異性高甲基化CpG島中有97個基因屬于HOX家族基因,這些基因涉及細胞分化、周期改變、粘附、侵襲與轉移以及血管生成等多個腫瘤發(fā)生機制;
　　3.SignalMap軟件分析這97個HOX家族基因,發(fā)現(xiàn)甲基化率最高的前15位基因是HOXA5、HOXA2、HOXA

4、11、HOXB4和HOXD13。BSP證實其各自的甲基化率為:HOXA5(95.38％)、HOXA2(94.29%)、HOXA11(91.67%)、HOXB4(90.56%)和HOXD13(94.38%);
　　4.PCR和Western-blotting結果顯示:在肝癌、膽管癌、胰腺癌和大腸癌等消化道腫瘤細胞株中,膽管癌細胞株TFK-1中HOXA5表達量最低。免疫組化顯示:相比于癌旁和正常膽管組織而言,膽管癌中HOXA5表達量明

5、顯降低。MSP證實:在甲基轉移酶抑制劑干預后,HOXA5在TFK-1中甲基化程度明顯降低。
　　結論:1.MeDIP芯片是篩選膽管癌早期診斷標志物的有效方法之一;
　　2.DNA甲基化可能是HOXA5在膽管癌中表達降低的重要原因,且HOXA5高甲基化可作為膽道腫瘤的早期診斷標志物之一。
　　PartⅡ無透鏡顯微鏡聯(lián)合細胞診斷芯片集成系統(tǒng)的構建
　　目的:微流控芯片實驗室(Lab-on-a-chip)技術越來越多地

6、用于細胞毒性檢測和藥物測試。該技術主要利用蝕刻技術到以各種材料制作的芯片上的通道和孔洞構成的“網(wǎng)絡”構建微型實驗室。實際應用時,壓力以精細控制的方式推動鈉升的體積流過通道,從而實現(xiàn)在單個集成的系統(tǒng)上進行樣品處理、混合、稀釋、電泳、定點追蹤以及色譜分析、染色和檢測。本實驗的目的是利用德國IBMT研究所先進的芯片實驗室,構建一種方便攜帶使用、成本低廉、快速分析、樣本和試劑消耗少的細胞診斷芯片。
　　方法:本實驗利用接觸式光學平板印刷技

7、術的原理構建了一種無透鏡熒光顯微鏡/光學顯微鏡聯(lián)合細胞芯片集成系統(tǒng)。生物樣本被放置在一個包含有一個1.5μl漏斗狀的腔及底部為1μm厚的硅氮化合物的MEMS芯片內(nèi)。再將芯片裝載在一個5兆彩色CMOS成像元件陣列上,最后在兩者間覆蓋一個光濾片。利用此系統(tǒng)培養(yǎng)鼠源性纖維細胞L929和人膽管癌細胞TFK-1。同時,分別用ErythrosineB和FITC進行細胞染色處理后,再比較此系統(tǒng)與傳統(tǒng)熒光顯微鏡的成像效果。
　　結果:1.該系統(tǒng)監(jiān)

8、測L929細胞及TFK-1細胞影像的對比度和清晰度與4x物鏡下的影像基本一致;
　　2.定點追蹤觀察單個或少量細胞形態(tài)變化,效果良好;
　　3.L929經(jīng)紅染或綠色熒光染色后,該系統(tǒng)顯示細胞形態(tài)清晰。
　　結論:該組件可用于動態(tài)定點監(jiān)測細胞形態(tài)變化和細胞的熒光圖像,為后期診斷芯片的進一步開發(fā)提供重要的參考數(shù)據(jù)。
　　第二部分雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒治療肝膽腫瘤的實驗研究
　　PartⅠ地西他濱和丙戊酸鈉單

9、用對人膽管癌生長抑制作用研究
　　目的:探討地西他濱(DAC)和丙戊酸鈉(VPA)單用對人膽管癌細胞株TFK-1、QBC939、HUCCT、CCLP1細胞增殖的影響,并探討其可能的機制。
　　方法:1.采用CCK8法檢測DAC、VPA單獨使用時對細胞生長的抑制率;
　　2.應用流式細胞儀檢測DAC、VPA單獨使用后細胞周期的變化;
　　3.經(jīng)Hochst33342/PI染色,光鏡下觀察經(jīng)DAC、VPA單獨使用后細

10、胞形態(tài)的變化,同時應用流式細胞術檢測處理后細胞凋亡情況;
　　4.光鏡下觀察經(jīng)DAC、VPA單獨使用細胞120h后,細胞分化的情況;
　　5.構建GFP-LC3質粒并轉染細胞,再加入DAC、VPA單獨使用處理72小時,熒光顯微鏡觀察細胞自噬情況;
　　6.體內(nèi)實驗采用裸鼠TFK-1細胞皮下種植瘤模型,觀察DAC、VPA單獨使用對瘤體生長及生存率的影響。
　　結果:1.DAC、VPA單獨使用對人膽管癌細胞的增殖抑制

11、作用呈時間和劑量依賴性;
　　2.流式細胞術檢測顯示,隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長,膽管癌細胞呈現(xiàn)明顯的G2/M或G0/G1期阻滯;
　　3.經(jīng)DAC、VPA單獨使用后,光鏡下可見凋亡的細胞呈明顯的胞體固縮、核固縮、核碎裂及凋亡小體形成。流式細胞術結果表明:細胞凋亡呈劑量依賴性;
　　4.光鏡下觀察到DAC、VPA單獨使用120h后,細胞形態(tài)呈樹突狀突起;
　　5.熒光顯微鏡下觀察到DAC、VPA單獨使用后

12、,細胞有明顯的自噬現(xiàn)象;
　　6.體內(nèi)試驗證明:當應用DAC或VPA后,總給藥時間為2周時,其對裸鼠TFK-1細胞皮下移植瘤的生長有明顯的抑制作用。而且,治療組的裸鼠生存期較對照組明顯延長。
　　結論:體外實驗和體內(nèi)實驗均證實,DAC或VPA對膽管癌細胞均具有明顯的生長抑制作用。
　　PartⅡ雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒對肝癌生長抑制的研究
　　目的:1.觀察雷公藤內(nèi)酯醇新型固體納米粒(TP-SLN)經(jīng)尾靜脈注射

13、給藥對SPF級BALB/C小鼠的急性毒性研究;
　　2.觀察TP-SLN對肝癌細胞株H22體外和荷瘤體內(nèi)的抗腫瘤作用研究
　　方法:1.雷公藤內(nèi)酯醇(TP)和TP-SLN分別作用于H22細胞24h、48h和72h后,CCK-8法檢測細胞的存活率;
　　2.SPF級BALB/c小鼠50只(雌雄各半),按照0.65mg/kg,0.773mg/kg,0.919mg/kg,1.189mg/kg,1.300mg/kg單次尾靜脈注

14、射給予TP-SLN,共5個劑量組。觀察小鼠單次給藥的癥狀體征,統(tǒng)計死亡率、體重等相應指標的變化;
　　3.建立H22細胞BALB/c小鼠皮下移植瘤模型,分為生理鹽水空白對照組,空白固體脂質納米粒組,雷公藤內(nèi)酯醇(TP)組,TP-SLN組,順鉑陽性對照組,隔日尾靜脈給藥后觀察記錄腫瘤的體積、體重、一般生長活動狀況。12天后處死所有小鼠,剝離腫瘤組織進行稱重。
　　結果:1.體外實驗中,TP-SLN對H22細胞生長抑制呈時間和劑

15、量依賴性,作用明顯且強于TP;
　　2.TP-SLN對于SPF級BALB/c小鼠尾靜脈注射途徑而言,其LD50值為0.891mg/kg,95%的可置信區(qū)間是0.814mg/kg—0.971mg/kg。并且在該劑距范圍內(nèi),TP-PM對于BALB/c小鼠而言,死亡率呈現(xiàn)良好劑量效應關系;觀察發(fā)現(xiàn):TP-PM對于SPF級BALB/c小鼠而言,在注射后的4hrs內(nèi)小鼠均未出現(xiàn)死亡,隨著時間的延長,部分小鼠癥狀逐漸加重抖動,共濟失調,進而活

16、動減少,活動抑制直至死亡;BALB/c小鼠死亡時間集中在24-48hrs,96hrs后絕大部分存活動物恢復正常的運動、呼吸等,體重上升。
　　3.與生理鹽水空白對照組比較,TP、TP-SLN及順鉑均引起腫瘤體積下降和體重減輕。抑瘤率分別為22.4%、49.2%、51.5%。TP、TP-SLN與生理鹽水空白對照組相比,小鼠的生活狀態(tài)(體重、反應能力等)均有一定的改善。順鉑組生活狀態(tài)無明顯改善。
　　結論:與TP相比,TP-SL

17、N體內(nèi)、外對肝癌細胞的抑制增強且穩(wěn)定、持久,副作用減弱。
　　PartⅢ地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉增強TP-SLN對人膽管癌細胞生長抑制作用的初步研究
　　目的:探討DAC聯(lián)合VPA能否增強TP-SLN對人膽管癌細胞殺傷作用。
　　方法:DAC聯(lián)合VPA預處理TFK-1細胞3天后,再加入TP-SLN處理24h、48h和72h,采用CCK-8法檢測細胞存活率。
　　結果:與未預處理組相比,地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉預處理后,T

18、P-SLN對人膽管癌細胞增值抑制作用明顯增強
　　結論:地西他濱聯(lián)合丙戊酸鈉預處理增強TP-SLN對人膽管癌細胞增值抑制效應。
　　第三部分應用無透鏡顯微鏡聯(lián)合細胞診斷芯片集成系統(tǒng)初探納米中藥對膽管癌細胞作用機制
　　目的:應用無透鏡顯微鏡聯(lián)合細胞診斷芯片集成系統(tǒng)觀察納米中藥與膽管癌細胞間相互作用
　　方法:應用無透鏡顯微鏡聯(lián)合細胞診斷芯片集成系統(tǒng)培養(yǎng)TFK-1細胞72小時后,培養(yǎng)基中加入TP-SLN,采集處理2