生物芯片技術(shù)及應(yīng)用

1、生物芯片技術(shù)及其應(yīng)用,,1.What is a microarray,Microarray 或 Biochip （生物芯片）是一種微型多參數(shù)生物傳感器。它通過在一微小的基片表面固定大量的分子識別探針，或構(gòu)建微分析單元和系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對化合物、蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞或其它生物組分準(zhǔn)確、快速、大信息量的篩選或檢測。A microarray is an ordered array of microscopic elements on a plan

2、ar substrate that allows the specific binding of genes or gene products.,1.What is a microarray,Four distinct characteristics of microarray :Microscopic target elements or spots;Planar substrates;Rows and columns of

3、 elements;Specific binding between microarray target element on the substrate and probe molecules in solution.,1.What is a microarray,Which is the probe?and which is the target?There are some differences between China

4、 and United States of America.In U.S.A. the probe are usually in solution.In China the probe is a reagent to detect target from sample.,Biochips的主要類別,?蛋白芯片 Protein chips(protein microarray)： 肽芯片，蛋白芯片 ?基因芯片 G

5、ene chips（Gene microarray）： 靶DNA芯片，多探針芯片 ③芯片實(shí)驗(yàn)室Laboratory-on-a-chip or Microfluidics-based chip,2.Microarray manufacturing,The three main manufacturing methods:Contact printing:uses direct contact

6、between the printing implement or the sample contained in the implement and the microarray substrate;Noncontact printing:on-the-fly printing including ink-jet tech.,microsolenoid tech.,and thermal bubble jet dispenser;

7、Semiconductor tech: photolithographic masks and micromirrors.,,Microscopic elements:①Semiconductor tech produce 15~30μm features② Printed spot size is 50~350 μm ③ Tissue spot is 200~600 μm Macroarrays contain sample

8、spot sizes of about 300 microns or larger microarray are typically less than 200 microns in diameter,Gene chips的制備,? 在片原位光刻合成 O d NTP- 5´-光敏保護(hù)基因,,光照,O dNTP-OH + dNTP -5´-保護(hù)基因,,,,,,,,?在片原位噴印合成,

9、Gene chips的制備,cDNA點(diǎn)樣法醛基修飾玻片 Silanized slide（與DNA上氨基反應(yīng)） Silane slide氨基修飾玻片 Silylated slide（UV照射與DNA交聯(lián)） Polylysine slide玻片氨基化舉例：,Nytran尼龍膜,點(diǎn)樣前變性 變性

10、的終濃度1×0.4N NaOH/10mM EDTA， 變性的擴(kuò)增産物被點(diǎn)樣到Nytran尼龍膜上， 用120mj/cm2UV交聯(lián)固定(Stratalinker 1800, Stratagene)點(diǎn)樣后變性 PCR擴(kuò)增産物被點(diǎn)入(或布陣)至Nytran尼龍膜 上之後,在0.4N NaOH/3M NaCl中浸濕5分鐘變 性DNA,隨後放在用6×SSC浸濕5分鐘中和，再

11、 用120mj/cm2UV交聯(lián)固定。,我們有世界第一部量產(chǎn)的點(diǎn)樣機(jī)及相關(guān)的配套生產(chǎn)線,核酸的雜交,常用的雙色熒光標(biāo)記試劑有Cy3-dNTP和Cy5-dNTP。它們在反轉(zhuǎn)錄過程中在DNA中的結(jié)合性好，激發(fā)和發(fā)射譜的間距大，以及光量子產(chǎn)率高。亦可標(biāo)記酶和生物素。,核酸的雜交,基因芯片實(shí)驗(yàn)程序,基因芯片實(shí)驗(yàn)程序,Gene chips的應(yīng)用,? 病原體的檢出 ? 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)譜 ? 位點(diǎn)突變 ? 遺傳性疾病

12、 ? 測序 ? 耐藥基因檢測 ? 疾病的分子分型 ? HLA分型,,,,,,,,,,,,,CGTTAGAT,ACGTTAGA,,ATACGTTAGATC,TACGTTAG,由雜交位置確定的一組核酸探針序列,GTTAGATC,,雜交探針組,,TATGCAATCTAG,重組的互補(bǔ)序列,靶序列,,TACGTTAG,,ACGTTAGA,,ATACGTTA,,CGTTAGAT,,GTTAGATC,,基因芯片的測序原理圖

13、,ATACGTTA,,蛋白芯片的原理,1.將抗原或抗體交聯(lián)（UV）或吸附在膜上,,,2. 抗體或抗抗體標(biāo)記示蹤①酶：HRPO、AKP②膠體金③熒光素：Cy3、Cy5、FITC、RB200、藻膽蛋白等,POTOMAC,點(diǎn)抗原測抗體,,3.檢測標(biāo)本中的抗體或抗原,POTOMAC,點(diǎn)抗原測抗體,POTOMAC,點(diǎn)抗體測抗體－捕獲法,POTOMAC,點(diǎn)抗體測抗原,POTOMAC,滲濾式蛋白芯片的設(shè)計(jì),將應(yīng)用物品先準(zhǔn)備好。,檢測實(shí)例,在晶片

14、盒視窗內(nèi)滴加3滴試劑A，必要時(shí)用手輕晃晶片，使膜表面完全浸濕。,待完全滲入後，室溫放置1分鐘，加待檢血清100μl。,待血清完全滲入後，再滴加6滴試劑B。,待試劑B完全滲入後，滴加10滴試劑C。,待試劑C完全滲入後，最後滴加6滴試劑D。,,反應(yīng)完畢後0.5小時(shí)內(nèi)，將晶片放入晶片閱讀系統(tǒng)進(jìn)行閱讀分析。,,大淵的PBT-X2-02型生物芯片識別儀器組成。,Protein chip的應(yīng)用,?微生物感染－病原體抗原、抗體的檢測?自身抗體的檢測

15、 ?特定蛋白的檢測 ? HLA分型 ? 過敏原檢測 ⑥腫瘤標(biāo)志的檢出,大淵結(jié)核菌多種抗原的 抗體檢測蛋白芯片系統(tǒng)特異性抗原：LAM、16KDa和38KDa蛋白LAM：脂阿拉伯甘露糖，其它分枝桿菌不具備或其含量甚低；38KDa蛋白：較牛分枝桿菌高10倍以上；16KDa蛋白：存在于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(人型、牛型、非洲型)中，其它分枝桿菌（MOTT）不存在。其綜合檢

16、出率可以達(dá)到93%,結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的脂阿拉伯甘露糖（LAM）是細(xì)胞壁重要組成成分。結(jié)核菌的LAM含量比其他分枝桿菌的含量高許多，因此許多研究都認(rèn)為檢測病人血清中的抗LAM抗體是診斷結(jié)核病的重要標(biāo)志之一。LAM要分布于細(xì)胞壁表面，組成成份為碳水化合物。主要生物學(xué)活性 1)   抗原性 2)   抑制T淋巴細(xì)胞增殖

17、 3)   破壞巨噬細(xì)胞的干擾素活化 4)   清除有毒的自由基 5)   抑制蛋白激酶等的活性 目前，LAM的主要用途是將其作為主要的包被或者點(diǎn)樣抗原，以檢測結(jié)核患者血清中的相應(yīng)抗體，用于結(jié)核病的診斷。,結(jié)核分枝桿菌脂阿拉伯甘露糖（以下簡稱LAM）,結(jié)核分枝桿菌MPT63抗原（16KDa）,結(jié)核菌MP

18、T63主要存在于培養(yǎng)濾液中，分子量達(dá)16kDa，其基因?yàn)镸PT63，表達(dá)159氨基酸（aa）的蛋白質(zhì)，29aa為信號肽，130aa為成熟蛋白。MPT63可在感染結(jié)核菌的豚鼠誘發(fā)體液免疫。MPT63基因僅發(fā)現(xiàn)于結(jié)核菌復(fù)合群（M tuberculosis complex, MTC）。MPT63與常見的鳥分枝桿菌（M avium）的蛋白沒有血清交叉反應(yīng)。 MPT63抗原的種特異性：非MTC分枝桿菌缺乏MPT63，表明MPT63是一個(gè)MTC

19、特異性抗原。證據(jù)有二：抗MPT63抗體與純化的MPT63，結(jié)核菌培養(yǎng)濾液，牛分枝桿菌PPD反應(yīng)，而不與鳥分枝桿菌PPD反應(yīng)。另一方面，采用競爭性ELISA，MPT63與抗MPT63的抗體的反應(yīng)可被牛分枝桿菌PPD顯著抑制，而不被鳥分枝桿菌PPD和BSA（無關(guān)蛋白）抑制，因此，MPT63沒有環(huán)境中常見的分枝桿菌抗原表位，其可作為非常有潛力的免疫診斷用抗原。,結(jié)核分枝桿菌的38kDa蛋白,,,它有不同的名稱，在美、日被稱為抗原5（Antig

20、en 5）,挪威將其稱之為抗原78（Antigen 78）。Coates等人利用免疫電泳技術(shù)測得其分子量為38kDa，故稱之為38kDa蛋白38kDa 蛋白為脂蛋白，存在于細(xì)胞外 ，含25%碳水化合物，是從細(xì)胞分泌的，理論分子量是為38200Da（含信號肽），其與細(xì)胞膜或者菌體表面的脂肪結(jié)構(gòu)相連 。 38kDa的反應(yīng)性：交叉免疫電泳技術(shù)（crossed immunoeleltrephoresis,CIE）證實(shí)結(jié)核菌和卡介苗均產(chǎn)生38

21、kDa蛋白，但前者的濃度顯著較后者高。分枝桿菌中只在結(jié)核菌和牛分枝桿菌（M boris）發(fā)現(xiàn)38kDa蛋白，而且結(jié)核菌的反應(yīng)強(qiáng)度較牛分枝桿菌強(qiáng)10倍 。抗-BCG多價(jià)抗體也能與38kDa蛋白反應(yīng) ，但BCG表達(dá)38-kDa蛋白的量很低 。結(jié)核分枝桿菌38kd抗原特異性100%，與正常健康人、MOTT感染和麻風(fēng)分枝桿菌感染無交叉。,TB蛋白芯片點(diǎn)陣排布,,識別色點(diǎn)質(zhì)控點(diǎn),LAM16KDa38KDaH2O,,,,,,,,,,

22、,,,,1,3,4,,,,,,,2,,,,,,4,4,1,1,2,2,3,3,1,2,3,4,大淵結(jié)核芯片系統(tǒng)與DIGFA試劑（上海奧普）檢測的總符合率,兩法檢測結(jié)核病人和對照組共1285份標(biāo)本，均陽性326例，均陰性769例，相符總數(shù)為1095例?？偡下蕿?5.21%。  武漢鋼鐵公司總醫(yī)院、哈爾濱市胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科、海南省農(nóng)墾總局醫(yī)院、 江蘇省人民醫(yī)院檢驗(yàn)中心 （組長單位）,,檢測抗結(jié)核分支桿

23、菌LAM、16和38kD抗原的抗體意義：,·鑒別痰涂片陽性者是否屬于結(jié)核桿菌感染。 ·提高痰涂片陰性患者的檢出率。 ·肺外結(jié)核的檢測。 ·痰涂陰性者的早期診斷。 ·可作為判斷對治療是否有效的指標(biāo)。,大淵心肌梗塞AMI檢測芯片,肌紅蛋白（Myoglobin）是早期診斷最重要的指標(biāo)1-2小時(shí)值升高 4-8小時(shí)達(dá)到高峰 20-36小時(shí)回到正常肌酸激酶同工酶（CK-MB

24、）是診斷AMI最信賴的心肌酶3-8小時(shí)值升高 8-24小時(shí)達(dá)到高峰 3天回到正常肌鈣蛋白I（Troponin I）是診斷心肌損傷最主要的指標(biāo)4-8小時(shí)值升高 12-16小時(shí)達(dá)到高峰 5-10天回到正常高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）4-8小時(shí)值升高 12-16小時(shí)達(dá)到高峰 5-10天回到正常,大淵蛋白芯片(AMI)對照檢測江蘇省人民醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心上海瑞金醫(yī)院檢驗(yàn)科 湖北省人民醫(yī)

25、院檢驗(yàn)科,,大淵STD芯片檢測系統(tǒng),本晶片含有UU第一群（含1，3，6，14等四個(gè)血清型）和第二群（含2，4，5，7，8，9，10，11，12，13等十個(gè)血清型）多種抗原，對兩群十四個(gè)血清型都能檢出。本晶片含有CT的沙眼生物變種（D~K型）和性病淋巴肉芽腫 （ LGV）生物變種可檢出UU/CT感染的85％以上。泌尿道感染中UU/CT感染占1/3。,大淵STD芯片對比檢測結(jié)果1.江蘇省人民醫(yī)院（組長醫(yī)院）， 2.安徽醫(yī)學(xué)院附

26、屬醫(yī)院， 3.南京皮膚病研究所， 4.武漢市華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院皮膚科,,大淵TORCH生物芯片,大淵TORCH芯片（IgM和IgG） ：檢測：弓形體、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒（Ⅰ、Ⅱ）的抗體用于優(yōu)生優(yōu)育，孕前和孕早期檢測IgM抗體陽性提示現(xiàn)癥感染，IgG抗體陽性提示有免疫力。,TORCH檢查的臨床意義,約有30%-46%其弓形體可通過胎盤傳給胎兒，直接影響胎兒的發(fā)育，導(dǎo)致畸形，甚至死亡。也可使孕婦流產(chǎn)，

27、早產(chǎn)，死產(chǎn)或增加妊娠并發(fā)癥。孕婦感染風(fēng)疹病毒后，胎兒出生后多患有白內(nèi)障等眼疾、耳聾、心血管系統(tǒng)缺損、精神運(yùn)動性障礙、紫癜等癥狀，重者可發(fā)生死亡和流產(chǎn)。,TORCH檢查的臨床意義,胎兒CMV感染后嚴(yán)重者則引起流產(chǎn)、死產(chǎn)，輕則造成出生體重偏低或畸形。嬰兒先天性感染常帶有明顯的遺留損害危險(xiǎn)，特別是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響較多。新生兒感染后死亡率高，存活者也大都發(fā)生智力降低，神經(jīng)性運(yùn)動障礙等。成人感染HSV的臨床表現(xiàn)往往是局部的，新生兒由于免疫力

28、底下，往往是全身散播性的，其病情較重，病死率高，幸存者往往有終身殘疾。,幽門螺旋桿菌（HP）IgG抗體蛋白芯片,大淵Hp抗體芯片檢測：細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA) 、尿素酶(Ure)和熱休克蛋白（HSP）臨床意義：根據(jù)HP菌株有無細(xì)胞毒素相關(guān)蛋白A(CagA)蛋白表達(dá)將其分為兩型：Ⅰ型是高毒力株，含CagA基因，表達(dá)CagA蛋白；這類菌株與胃、十二指腸潰瘍及誘發(fā)癌變密切相關(guān)。幾乎所有的野生型HP都產(chǎn)生尿素酶(Ure)，Urc抗體

29、的產(chǎn)生是Hp感染的標(biāo)志。 HSP是一種應(yīng)激蛋白， HP與HSP檢測結(jié)果同為陽性，表示HP正在發(fā)揮致病作用，需要及時(shí)治療。另外，研究發(fā)現(xiàn)HSP60與胃癌的發(fā)生有密切的關(guān)連。,大淵自身抗體生物芯片,大淵自身抗體芯片：檢測：dsDNA,Histone,SSA/Ro,SSB/La,Sm,RNP,Jo-1,Scl-70,Rib-P的自身抗體用于自身免疫病的診斷檢查：系統(tǒng)性紅斑狼瘡、藥物性狼瘡、混合性結(jié)締組織病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化癥、

30、多發(fā)性肌炎、干燥綜合征等。,POTOMAC,中國生物芯片申報(bào)現(xiàn)況之一 20031128已批準(zhǔn)部份C12腫瘤蛋白芯片 湖州數(shù)康丙型肝炎病毒抗體芯片 深圳益生堂HP蛋白芯片 大淵UU CT HPV抗體芯片 大淵 地中海貧血基因芯片,POTOMAC,中國生物芯片申報(bào)現(xiàn)況之二 20031128已受理部份乙型肝炎病毒基因多態(tài)性檢測芯片丙型肝炎病毒

31、抗體芯片AMI四項(xiàng)定量蛋白芯片（經(jīng)檢定全部合格） 大淵UU CT抗體芯片 （經(jīng)檢定全部合格） 大淵TB抗體檢測芯片 （經(jīng)檢定全部合格，即將拿到證書） 大淵SARS基因芯片 TORCH蛋白芯片 （經(jīng)檢定全部合格） 大淵自身抗體九項(xiàng)檢測蛋白芯片 （經(jīng)檢定全部合格） 大淵,POTOMAC,中國生物芯片申報(bào)現(xiàn)況之三 20031128檢定中部份HLA-DR分型基因芯片HLA-AB分型基因芯片SARS流感

32、腸道核酸螢光芯片乙丙型肝炎基因芯片SARS基因芯片TB耐藥基因芯片 大淵食品藥物殘留芯片 大淵,大淵蛋白芯片的特點(diǎn)：a. 多種特異性抗原或抗體的同時(shí)檢測；b. 較單一指標(biāo)明顯提高檢測的敏感性、特異性；可單人份操作，需時(shí)短，簡單。 應(yīng)用多種高新技術(shù)：基因重組技術(shù)、單抗技術(shù)、分子標(biāo)記技術(shù)、斑點(diǎn)金免疫滲濾技術(shù)、微陣列技術(shù)、圖像數(shù)字信息處理技術(shù)。,POTOMAC,大淵的發(fā)展,第二、三代閱讀儀