家蠶雛翅突變基因(mw)的定位與候選基因分析.pdf

1、翅膀?qū)τ诶ハx的覓食、求偶、躲避敵害、擴(kuò)大分布等有重要的作用。自然選擇使昆蟲都是朝著最有利于它們生存、繁衍的方式進(jìn)化，所以昆蟲才有了千姿百態(tài)的翅。家蠶是鱗翅目昆蟲，也是遺傳研究的模式昆蟲。家蠶翅膀經(jīng)過人工選擇，已經(jīng)喪失了飛行能力，翅膀也嚴(yán)重退化。與翅相關(guān)的基因突變會(huì)使家蠶成蟲出現(xiàn)不同翅形或者異常的翅顏色。目前，資料記載的翅突變體有20余份，已有報(bào)道稱有些參與翅形成的基因同時(shí)也在其整個(gè)發(fā)育的過程中起著重要作用，比如胚胎發(fā)育、體節(jié)形成、腿的發(fā)

2、育和家蠶的絲腺發(fā)育等方面。所以，研究這些基因在翅形成中的功能也能為生物體的發(fā)育研究提供參考。另外，害蟲的飛行能力是其擴(kuò)散和交配產(chǎn)卵所必須的，研究昆蟲的翅膀發(fā)育及突變機(jī)制，對(duì)害蟲的遺傳學(xué)防治也能有很好的借鑒作用。
　　家蠶雛翅基因（minute wing，mw）突變是家蠶翅突變的一種，由隱性基因mw控制，其突變體在蛹期和成蟲期翅膀明顯小于正常翅。mw基因已經(jīng)被學(xué)者證明位于家蠶第22連鎖群。本研究利用STS分子標(biāo)記技術(shù)和CRISPR/

3、Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組重新編輯技術(shù)，分別對(duì)其進(jìn)行定位和功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，主要內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.對(duì)mw基因的初步定位和連鎖分析
　　供試家蠶品種正常翅型P50和突變體雛翅品種U11均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提供。用U11和P50作為親本組建F1代及BC1回交群體(U11×P50)×U11和U11×(U11×P50)，分別記作BC1F和BC1M。根據(jù)雌性家蠶的W與Z染色體不發(fā)生交換的特點(diǎn)，用BC1F群體驗(yàn)證連鎖群，用BC

4、1M群體構(gòu)建遺傳連鎖圖，尋找與mw基因連鎖的分子標(biāo)記。結(jié)果顯示在第22連鎖群上發(fā)現(xiàn)5個(gè)多態(tài)STS標(biāo)記(T2210、T2238、T2269、T2272、T2298)，這5個(gè)標(biāo)記在BC1F群體擴(kuò)增所有正常翅形個(gè)體均表現(xiàn)出與F1相同的電泳帶型，即雜合帶型；而所有雛翅個(gè)體擴(kuò)增帶型與U11一致，為純合帶型；用BC1M群體采用作圖軟件Mapmaker3.0，重組值設(shè)定為5.0（LOD取5.0），繪制出mw基因的遺傳連鎖圖。繪制的遺傳連鎖圖的遺傳距離

5、為12.4cM，mw基因位于nscaf3056末端，T2272與mw基因距離最近，他們之間的遺傳距離為1.1cM。
　　2.對(duì)雛翅基因mw的精細(xì)定位及候選基因分析
　　經(jīng)與家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，T2272位于家蠶基因組精細(xì)圖的nsca f3056的1.265Mb處，與突變基因連鎖圖的結(jié)果一致。與mw基因距離最近的標(biāo)記T2272至該scaffold末端基因組大小為275 kb。我們?cè)谶@個(gè)區(qū)域另外設(shè)計(jì)了多對(duì)引物，但是沒有檢測(cè)到多

6、態(tài)性標(biāo)記。在這個(gè)大小為275 kb的區(qū)域內(nèi)，共有15個(gè)預(yù)測(cè)基因，其中基因BGIBMGA012725-TA在果蠅中的同源基因的功能與翅原基發(fā)育有關(guān)。經(jīng)過克隆測(cè)序，我們沒有發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因在家蠶正常體P50和突變體U11翅原基中有表達(dá)差異。
　　取家蠶品種正常翅形p50和突變體雛翅品種u11的熟蠶1-3天的翅原基，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行普通 PCR擴(kuò)增，比較親本間各基因的表達(dá)差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因BGIBMGA012754-TA在

7、正常體P50翅原基中都表達(dá)而在突變體U11翅原基中都不表達(dá)，因此此基因極有可能就是雛翅突變的關(guān)鍵基因。對(duì)此基因進(jìn)行5’和3’RACE-cDNA擴(kuò)增，可能因?yàn)橐锘蚴窃摶蚪Y(jié)構(gòu)問題，未能得到此基因的全長(zhǎng)。
　　3.候選基因功能驗(yàn)證
　　CRISPR/Cas介導(dǎo)的家蠶基因組編輯是利用向?qū)NA攜帶Cas9核酸內(nèi)切酶對(duì)特定的DNA片段（PAM序列）進(jìn)行切割以非末端同源性重組的修復(fù)方式使目的基因產(chǎn)生突變從而干擾其基因的表達(dá)。通過CR