家蠶Wibg基因的表達(dá)與定位分析功能的初步研究.pdf

1、我們從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的家蠶cDNA文庫中篩選得到一條cDNA,經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其包含一個(gè)小的Mago-bind superfamily保守結(jié)構(gòu)域,命名為Bormbyx mori Within bgcnhomolog(Bm Wibg)。BmWibg基因含有一個(gè)內(nèi)含子,cDNA長為853bp,ORF大小為582bp,編碼193個(gè)氨基酸殘基,預(yù)測分子量為21.86kD,等電點(diǎn)為9.538。
　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)cDNA序列的ORF框設(shè)計(jì)

2、上下游引物,PCR擴(kuò)增出目的基因,插入融合表達(dá)載體pET-28a(+),成功構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)PCR、酶切鑒定以及測序分析證實(shí)重組正確。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,菌體誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE鑒定目的蛋白表達(dá)成功,并通過Ni-NTA柱親和層析得到純化的重組蛋白,經(jīng)質(zhì)譜鑒定蛋白大小與預(yù)測的相符。用該重組蛋白免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體,ELISA檢測效價(jià)在1:25600以上。提取家蠶各時(shí)期及組織的RNA,設(shè)計(jì)特異

3、引物利用RT-PCR檢測BmWibg在轉(zhuǎn)錄水平上差異。結(jié)果表明:在各時(shí)期中,基因BmWibg在卵中的轉(zhuǎn)錄水平最高,蛾中最低;各組織中.BmWibg基因在精巢中的轉(zhuǎn)錄水平最高。提取家蠶卵、五齡幼蟲、蛹和蛾四個(gè)時(shí)期及五齡幼蟲的頭、精巢和絲腺等組織的總蛋白,進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示,BmWibg蛋白在家蠶五齡幼蟲、蛹和卵均檢測到表達(dá)信號,而在蛾中沒有檢測到BmWibg蛋白,在組織中只檢測到絲腺、精巢和頭。ELISA半定量結(jié)果顯示,各時(shí)期中蛋