家蠶BmNPV抗性基因的篩選與定位.pdf

1、家蠶是鱗翅目模式昆蟲，也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲。在中國(guó)和印度等發(fā)展中國(guó)家，蠶絲具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，是很多地區(qū)農(nóng)民的主要收入來(lái)源。但是，家蠶病害的發(fā)生也給桑蠶業(yè)帶來(lái)了極大困擾。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，每年因家蠶病害造成的損失約為總產(chǎn)量的三成，嚴(yán)重制約了蠶桑產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展。病毒病是蠶業(yè)生產(chǎn)上危害最大的疾病，其中家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV）引起的血液型膿病危害最大，約占蠶病損失

2、的70％，該蠶病目前還停留在預(yù)防階段。因此從生產(chǎn)和安全方面來(lái)講，家蠶核型多角體病毒抗性基因的尋找和抗性品種的組配都是一項(xiàng)重要工作。
　　本課題采用耐BmNPV蠶品種華康2號(hào)一代雜交種同蛾區(qū)交配形成的近交系抗性品系A(chǔ)N、抗BmNPV蠶品種野三元N中的抗性親本野BN、BmNPV中等抗性蠶品種大造（p50）和易感性品系 C108作為研究材料，首先對(duì)不同家蠶品種對(duì)BmNPV抵抗力大小進(jìn)行研究。在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建抗性主基因連鎖分析群體和定位群

3、體，通過(guò)遺傳育種技術(shù)、SSR分子標(biāo)記技術(shù)、HRM分析技術(shù)對(duì)抗性主基因進(jìn)行精細(xì)定位；用抗性品系A(chǔ)N、p50與C108構(gòu)建基因分離群體，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)、HRM分析技術(shù)對(duì)BmNPV抗性微效基因進(jìn)行初步連鎖分析。主要實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　1、家蠶AN品系BmNPV抗性主基因的精細(xì)定位
　　本研究根據(jù)抗性主基因的遺傳規(guī)律以及家蠶對(duì)BmNPV的耐受性，選擇抗性品系A(chǔ)N作為母本（P1），感性品系C108作為父本（P2）及回交本

4、，二者雜交組配F1群體；F1代雌性個(gè)體回交C108雄性個(gè)體組配BC1F，后代飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食 BmNPV病毒多角體濃度為1×108/mL浸漬的桑葉，收集存活個(gè)體作為BC1F連鎖分析群體；F1代雄性個(gè)體回交 C108雌性個(gè)體組配 BC1M，飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食BmNPV病毒多角體濃度為1×108/mL浸漬的桑葉，收集存活個(gè)體作為 BC1M定位分析群體。以此類推，組配BC2F和BC2M群體。用P1、P2和F1為模板，篩選與抗性主基因連鎖

5、的多態(tài)性標(biāo)記；用BC1F和BC2F群體對(duì)抗性主基因進(jìn)行連鎖分析，確定其連鎖群；用 BC1M和 BC2M群體對(duì)其進(jìn)行定位分析。
　　AN品系對(duì)BmNPV抗性鑒定結(jié)果表明，在2齡起蠶經(jīng)口添食BmNPV病毒多角體時(shí)，半數(shù)致死濃度（LC50）為2.154×109個(gè)/mL，半數(shù)致死劑量（LD50）為1.436×107個(gè)/頭蠶。
　　綜合F1、BC1、BC2的經(jīng)口接種BmNPV病毒多角體的半數(shù)致死濃度（LC50）結(jié)果可以認(rèn)為，AN品系對(duì)

6、BmNPV具有高度抗性，該性狀受1個(gè)位于常染色體的顯性主基因控制，性染色體對(duì)AN品系BmNPV高抗性沒有影響。
　　通過(guò)SSR分子標(biāo)記HRM分析技術(shù)進(jìn)行連鎖分析表明，家蠶AN品系BmNPV抗性主基因位于家蠶第27連鎖群。通過(guò)BC2M定位群體600余個(gè)體的基因組定位分析，繪制了遺傳總距離為29.1cM的AN品系BmNPV抗性主基因遺傳連鎖圖，SSR標(biāo)記 s2800-9（nscaf2800:1311765~1311847）和 SSR標(biāo)

7、記 s2801-35(nscaf2800:117840~118038)位于該基因兩側(cè)，抗性主基因與2個(gè)標(biāo)記的遺傳距離分別為5.2cM和2.9cM，由于兩個(gè)標(biāo)記間家蠶基因組序列存在一個(gè)gap，因此暫時(shí)無(wú)法實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步的精細(xì)定位。
　　2、家蠶野BN品系BmNPV抗性主基因的定位分析
　　以BmNPV抗性品種野BN作為父本（P1），感性品系C108作為母本（P2）及回交親本，二者雜交組配F1群體；F1代雌性個(gè)體回交C108雄性個(gè)體

8、構(gòu)建BC1F群體，后代飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×108/mL的BmNPV病毒多角體懸液浸漬的桑葉，收集存活個(gè)體作為 BC1F連鎖分析群體；F1代雄性個(gè)體回交C108雌性個(gè)體構(gòu)建BC1M群體，飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×108/mL的BmNPV病毒多角體懸液浸漬的桑葉，收集存活個(gè)體作為 BC1M基因組定位群體。以此類推，組配BC2F和BC2M群體。
　　野BN對(duì)BmNPV抗性鑒定結(jié)果表明，在2齡起蠶經(jīng)口添食BmNPV病毒多角體

9、時(shí)，野BN的半數(shù)致死濃度（LC50）為2.083×109個(gè)/mL，野BN的半數(shù)致死劑量（LD50）為2.5×107個(gè)/頭蠶。
　　BC1F群體連鎖分析結(jié)果表明，野BN品種在第27連鎖群上存在著1個(gè)抗性主基因、其他連鎖群上可能還存在抗性主基因。
　　通過(guò)對(duì)4個(gè)蛾區(qū)BC2M定位分析群體、第27連鎖群6個(gè)多態(tài)性標(biāo)記的HRM分析結(jié)果表明，野BN品種除了在第27連鎖群上存在著1個(gè)BmNPV抗性主基因外，在27連鎖群以外確實(shí)存在著1個(gè)能

10、夠耐受1×108/mL的BmNPV病毒多角體懸液浸漬桑葉經(jīng)口添毒的抗性主基因。
　　3、抗性微效基因的連鎖分析
　?。?）抗性品系A(chǔ)N
　　家蠶抗性品系A(chǔ)N對(duì)BmNPV的抗性基因，除抗性主基因外還存在較多的抗性微效基因。選擇抗性品系A(chǔ)N作為母本（P1），易感性品系C108作為父本（P2）和回交親本，得到BC2F群體，飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×107/mL的核型多角體病毒懸液浸漬桑葉，收集存活個(gè)體再對(duì)其進(jìn)行第27連鎖

11、群分子標(biāo)記基因型鑒定，選擇其中無(wú)AN品系來(lái)源第27連鎖群（染色體）即無(wú)抗性主基因存在的蛾區(qū)，組配BC3F、BC4F群體作為構(gòu)建抗性微效基因的連鎖分析群體。連鎖分析發(fā)現(xiàn)，第6連鎖群上存在抗性微效基因。
　?。?）抗性品系p50
　　選擇抗性品系p50作為母本（P1），易感性品系C108作為父本（P2）及回交本，二者雜交組配 F1群體；F1代雌性個(gè)體回交 C108雄性個(gè)體，后代飼養(yǎng)至2齡起蠶后添食濃度為1×107/mL的BmNP