體外原代肝細胞不同培養(yǎng)方式的比較研究.pdf

1、1056060【tl；罔分類號】洳；≥、甍碩士學位論文(臨床醫(yī)學專業(yè)學位)⑧2051852l論文題目佳生b厘拭旺細胞丕回擅差直式毆出越班囂作者姓名——置』毛_擅——一指導教師——韭]L盅L—一學科(專業(yè))由拄堂f置臟癌堂1所在學院———醫(yī)jL臆——一提交日期2Q盟生Q且浙江大學頑b學位論文【研究方法】l。大鼠肝細胞的收獲：體重2509左右的6周齡雌性SD大鼠使用4％水合氯醛按tOml／kg行腹腔注射，使用肝素鈉按50mg／kg行皮下注射

2、，麻醉后仰臥固定，腹部消毒后按照兩步膠原酶灌流法收獲肝細胞。2單層平板貼壁培養(yǎng)：直徑7cm平皿中加入02ml膠原溶液(023mg鼠尾膠原溶解于lml01％乙酸)，鋪層，放置超凈臺吹干。使用前用無菌PBS洗滌平皿3次，加入8ml預熱的含血清培養(yǎng)基。每個平皿接種15106cells，輕輕搖勻二氧化碳培養(yǎng)箱中(370c，5％C02)培養(yǎng)4h后細胞貼壁完好，開始形成島狀。一般每2天更換一次培養(yǎng)基。3聚球體轉瓶培養(yǎng)：籍新鮮收獲的原代人肝細胞用含有

3、01mg／mlI型膠原的培養(yǎng)基混懸。肝細胞接種濃度為1XlO。cells／llIL，置入轉瓶中密封培養(yǎng)。24小時內細胞形成聚球體。一般每2天更換一次的培養(yǎng)基。4尿素測定：培養(yǎng)基取樣后，自動生化分析儀行尿素氮含量測定。5白蛋白分析：培養(yǎng)基取樣后，白蛋白含量以酶聯免疫(ELISA)法測定，吸光度由bio—rad酶標儀在450nm波長下測定。6細胞活率測定：MTT法，在570hm波長下，以對照孔為參照測定每孔吸光值。【結果】平扳貼壁的肝細胞初

4、始細胞包埋量為188Xl∥cells／mL，轉瓶內的初始細胞包埋量為997X105cells／mL。1臺盼蘭定性觀察細胞：單層平板貼壁培養(yǎng)的細胞在培養(yǎng)4小時后細胞即貼壁完好，而聚球體轉瓶培養(yǎng)的肝細胞則經歷了一個“積聚”的過程，24小時內形成聚球體。2MTT法測定細胞活率：聚球體組在l天內活率下降至原來的70％左右，第3天后穩(wěn)定在48％左右。而單層貼壁組第l天內即下降至原來的54％左右，第3天后細胞活率穩(wěn)定在20％左右。聚球體組與單層貼壁