生物轉化法生產天然手性γ-癸內酯.pdf

1、γ-癸內酯具有桃子的香氣，存在于多種食品中，是香精香料行業(yè)廣泛應用的一種香原料。過去，γ-癸內酯主要是從水果中提取或是化學合成的，隨著消費者對天然產品需求的上升，研究人員開始使用生物技術制取γ-癸內酯的方法。 微生物法是生產較安全的、高生物活性的香味化合物及其復合物最有前途的方法。有許多專利和文獻報道關于微生物法合成γ-癸內酯的工藝，使用如Sporidiobolusruinenii、Sporidiobolussalmonicol

2、or、Yarrowialipolytica、Sporobolomycesodorus等菌種，均能利用蓖麻油、蓖麻油酸或蓖麻油酸甲酯生產γ-癸內酯。由于微生物法生產的γ-癸內酯大多具有旋光活性，在香料行業(yè)有特殊的用途，本研究選擇了采用微生物轉化法生產γ-癸內酯的路徑。 本研究的工作包括： 1.對文獻報道的產內酯菌株進行了篩選，得到一株較為適宜的菌株YarrowialipolyticaAs2.1405作為出發(fā)菌株，并確定了初

3、篩培養(yǎng)基配方和條件，初始搖瓶平均產量為0.6g/L。 2.YarrowialipolyticaAs2.1405連續(xù)經過紫外誘變、NTG誘變、DES誘變和鈷60誘變，最終篩選得到一株高產內酯菌種167＃，搖瓶平均產量為1.4g/L，遺傳穩(wěn)定性良好。 3.對培養(yǎng)基配方中的碳、氮源以及一些維生素和無機鹽離子濃度進行了優(yōu)化試驗。經過培養(yǎng)基配方優(yōu)化，確定了最優(yōu)組合配方。其工藝條件經優(yōu)選為：裝液量50mL/500mL，pH6.5，培

4、養(yǎng)溫度28℃，搖床轉速200rpm，發(fā)酵48小時，癸內酯平均產量2.04g/L。 4.研究了γ-癸內酯及其相應羥基酸—4-羥基癸酸(4-HydroxydecanoicAcid，HA)對Yarrowialypolytica菌株生長的影響，80mg/L的癸內酯就已對菌體生長產生了強烈的抑制作用，癸內酯濃度達到200mg/L以上時，菌體完全不生長，說明癸內酯對YarrowiaLypolytica菌體細胞有較強的毒性。羥基酸濃度低于20

5、0mg/L時基本不影響菌體的生長，羥基酸濃度達到400mg/L時才開始對菌體生長出現抑制。比較γ-癸內酯和4-羥基癸酸對菌體最太生長速率的影響可以看出4-羥基癸酸對Yarrowialypoiytica菌株的生長也有—定的影響，但毒性相對于γ-癸內酯要小得多。因此在發(fā)酵生產γ-癸內酯的過程中，應盡量控制產物以羥基酸的形式存在，以減小產物對細胞的抑制。 5.經過搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化后，利用5L和50L自控發(fā)酵罐進行放大試驗。試驗表明溶

6、氧、轉速以及蓖麻油的添加方式對于發(fā)酵產率有較大的影響。在適宜的溶氧和轉速的條件下，在發(fā)酵初期種子生長階段不添加蓖麻油或添加少量蓖麻油進行誘導，種子生長旺盛后再加入大量蓖麻油進行轉化，癸內酯產量達到3.2g/L以上，有效提高了蓖麻油的轉化率，癸內酯產量比原始出發(fā)菌種提高了5倍。 6.對發(fā)酵液后處理進行了摸索，確定了后處理工藝：發(fā)酵結束后發(fā)酵液經酸化、加熱、離心、有機溶劑萃取、溶劑回收、粗餾、精餾等一系列操作最終得到γ-癸內酯產品，

7、并確定了各操作單元的工藝參數。最終產品純度：98.3％，旋光度[()]20D：+38.12度(理論值為+48.5度)，對映體過量率(e.e.％)：93.42％，產品質量指標達到國際水平。 由于粗餾和精餾過程溫度較高，時間較長，終產品中易混有焦糊昧，因此探索了利用超臨界二氧化碳萃取來替代高溫減壓蒸餾過程。試驗結果表明超臨界二氧化碳萃取和分餾過程聯用，對癸內酯進行粗提，可以取得較好效果。 7.在50L自控罐的試驗數據基礎上進