SATB2基因轉(zhuǎn)染促進鈦種植體的骨結(jié)合.pdf

1、種植體在臨床的應用越來越廣泛，除了修復和替代缺失牙齒外，在上下頜骨的整形修復中也被大量使用，種植體治療已經(jīng)成為一個標準和常規(guī)的程序。
　　 種植體成功的一個重要標志就是形成骨結(jié)合，骨結(jié)合是在光學顯微鏡水平觀察到的種植體和宿主骨的直接接觸形式，此狀態(tài)下種植體可以承受壓力并行使功能。骨結(jié)合一個重要的前提條件就是種植體周圍新骨的生成。但是在種植體植入后，種植體周圍骨再生相對比較慢。而且在初始愈合期以后，由于種植體周圍新形成骨的骨密度比

2、較低，種植體周圍的骨組織對種植體的支持有限，因此對種植體骨結(jié)合的研究依然面臨很大的挑戰(zhàn)。很多的基礎和臨床研究致力于如何通過縮短種植體骨結(jié)合的時間來縮短治療周期，提高治療的效率。為了實現(xiàn)這個目標，最常見的方法就是通過改變種植體的設計參數(shù)來實現(xiàn)，這些改變包括種植體的材料，種植體外形的修改以及種植體表面的修飾。目前認為，種植體的骨結(jié)合是通過成骨細胞的活動來完成的，大部分對種植體表面的修飾都是為了促進或者改善種植體周圍組織中細胞對種植體的反應。

3、除了通過對種植體表面的修改來促進種植體的骨結(jié)合，也有一些通過系統(tǒng)或者局部應用與成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子或者生長因子增加骨-種植體的結(jié)合。Satb2是近幾年來發(fā)現(xiàn)的在成骨細胞的分化以及牙和顱頜面發(fā)育中起重要重要作用的轉(zhuǎn)錄因子。Satb2可以與成骨分化相關(guān)的重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx以及Atf4等協(xié)同作用，提高其在骨骼發(fā)育及成骨細胞分化中的調(diào)節(jié)作用，并可以直接結(jié)合于成骨細胞特異性基因BSP和OCN的啟動子促進BSP和OCN的表達，另外，S

4、atb2可以下調(diào)成骨細胞中抑制骨形成的Hoxa2的表達而促進成骨細胞的分化和成骨。Satb2基因敲除鼠的胚胎顯示多發(fā)的顱頜面缺陷，包括下頜骨明顯的短小，鼻骨和上頜骨的發(fā)育不足，舌骨的畸形以及腭裂，且基因敲除小鼠一般在出生后立即死亡，在對Satb2基因敲除鼠的成骨細胞的研究中發(fā)現(xiàn)：其成骨細胞的分化和功能存在缺陷，骨的形成和鈣化延遲，基質(zhì)中膠原的表達顯著降低，在細胞外基質(zhì)的沉積中存在明顯的缺陷。研究者認為，Satb2在成骨細胞的分化以及顱頜

5、面的發(fā)育中是一個重要的骨發(fā)育性調(diào)節(jié)分子，是骨骼發(fā)育以及成骨細胞分化的基因調(diào)控系統(tǒng)中的分子樞紐。因此有理由相信，Satb2在骨形成及骨重建中起到重要的調(diào)節(jié)作用，是未來骨修復和骨組織工程中理想的候選因子。
　　 因此本實驗納入Satb2作為研究對象，采用RCAS或pBABE-Hygro兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)，以基因轉(zhuǎn)染的方法將Satb2過表達于植入BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠中的種植體周圍，觀察Satb2局部高表達在種植體周圍成骨及骨

6、結(jié)合中的作用。這兩種不同的病毒表達載體感染BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠的細胞不同。其中RCAS逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)可以使編碼Satb2的病毒RCAS-Satb2特異性感染種植體周圍組織中BSP陽性的細胞，而pBABE-Hygro-Satb2逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)可以感染種植體周圍所有分裂期細胞。通過檢測兩組結(jié)果的異同，可進一步了解不同細胞參與種植體周圍組織的成骨是否存在差異。同時，采用局部使用高表達Satb2骨髓基質(zhì)細胞的辦法，檢測局部使用Sat

7、b2基因轉(zhuǎn)染的骨髓基質(zhì)細胞在種植體骨結(jié)合中的作用。從而探討Satb2基因治療促進種植體骨結(jié)合的效果及基因轉(zhuǎn)染方式。
　　 材料和方法：
　　 第一部分：本實驗納入了研究成骨的理想的動物模型：BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠。該轉(zhuǎn)基因小鼠利用獨特的RCAS-TVA系統(tǒng)，通過4.9kb的BSP啟動子控制TVA基因的表達，使TVA基因選擇性表達在成骨細胞中，表達TVA的分裂期哺乳細胞可以很容易被RCAS感染。成功構(gòu)建RCAS-Satb

8、2逆轉(zhuǎn)錄表達載體。在種植體植入BSP-TVA小鼠的股骨的遠心端前，將含有108 cfu/ml的編碼Satb2或者RCAS空載體的逆轉(zhuǎn)錄病毒3μl注入種植體窩。術(shù)后1周及3周取材，通過H&E染色觀察種植體周圍組織的成骨情況，采用H&E染色、BSP免疫組化染色和組織學測量評價Satb2高表達在種植體的愈合及骨結(jié)合中的作用。同時對術(shù)后1周及3周種植體上下1mm范圍的骨組織提取RNA后，通過Real-time RT-PCR檢測組織中Satb2及

9、成骨相關(guān)基因Osx、Runx2、BSP、COLI及OC的表達情況，觀察Satb2在實驗組和對照組組織中的變化。
　　 第二部分：實驗采用了另外一個不同的病毒表達系統(tǒng)，pBABE-Hygro逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體系統(tǒng)。在成功包裝pBABE-Hygro-Satb2及pBABE-Hygro病毒并將病毒滴度調(diào)整到108cfu/ml后，我們采用與第一部分相同的手術(shù)方法及檢測方法對pBABE-Hygro-Satb2促進種植體骨結(jié)合的作用進行了檢

10、測。
　　 第三部分：應用pBABE-Hygro-Satb2及pBABE-Hygro逆轉(zhuǎn)錄病毒體外感染EGFP標記的BMSCs，檢測感染后2天，9天及23天的BMSCs中Satb2及成骨相關(guān)基因Osx、Runx2、BSP、COLI及OC的表達。將感染后48小時的BMSCs細胞懸液局部應用于B6D2F1小鼠股骨的種植體部位，采用與第一部分相同的實驗方法對超表達Satb2的BMSCs在種植體的骨結(jié)合中的作用進行檢測。同時用GFP免疫

11、組化染色的方法追蹤外源性的BMSCs在組織中的去向及功能。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分：局部使用RCAS及RCAS-Satb2病毒，術(shù)后1周，H&E染色結(jié)果顯示：種植體周圍有新形成的編織骨；與種植體直接接觸的宿主組織中，活化的成骨樣細胞排列規(guī)律，呈復層圍繞種植體；周圍組織中還有一些炎癥細胞的浸潤。實驗組中種植體周圍的骨面積百分比(％bone area)高于對照組，但差異無顯著性。實驗組中，與種植體直接接觸的宿主組織已有

12、30％左右與種植體形成骨結(jié)合，可見處于活躍期的成骨細胞，實驗組中宿主與種植體發(fā)生骨結(jié)合的區(qū)域是對照組2倍。采用Real-timeRT-PCR技術(shù)對種植體周圍1mm范圍內(nèi)成骨相關(guān)基因的檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：實驗組中Satb2的表達增加約3倍，Osx，Runx2，BSP，COLI和OC的表達也顯著增加。而BSP免疫組化結(jié)果與實時定量檢測BSP的結(jié)果一致，實驗組中BSP的陽性細胞數(shù)和間質(zhì)中BSP的信號都高于對照組。
　　 術(shù)后3周，種植體被大

13、量的骨組織包繞，與種植體直接接觸的部位，有編織骨及板層骨，周圍的組織中已經(jīng)沒有明顯的炎癥。H&E染色組織測量結(jié)果顯示：3周時，實驗組中種植體周圍的骨面積百分比高于對照組，宿主組織與種植體之間的結(jié)合主要為骨結(jié)合，實驗組中與種植體直接接觸的宿主組織已有80％左右與種植體形成骨結(jié)合，實驗組中骨結(jié)合區(qū)域的比例是對照組的1.4倍。同時檢測了3周時，種植體周圍1mm范圍內(nèi)Satb2及成骨相關(guān)基因的表達，實驗組中Satb2，Osx，Runx2，BSP

14、，COLI和OC的表達均略高于對照組，但差異均無顯著性。而BSP免疫組化的計數(shù)結(jié)果在實驗組和對照組也無顯著差異。
　　 第二部分：局部使用pBABE-Hygro及pBABE-Hygro-Satb2逆轉(zhuǎn)錄病毒，術(shù)后1周，H&E染色結(jié)果顯示：種植體周圍出現(xiàn)新形成的編織骨，與種植體直接接觸的部位，活化的成骨樣細胞排列規(guī)律整齊，呈復層圍繞種植體，周圍的組織中可見少量的炎癥細胞浸潤。實驗組中種植體周圍的骨面積百分比高于對照組。與種植體直接

15、接觸的宿主組織已有10％左右與種植體形成骨結(jié)合，實驗組中宿主與種植體發(fā)生骨結(jié)合的區(qū)域大于對照組，但差異無顯著性。Real-time RT-PCR結(jié)果顯示：術(shù)后1周，實驗組中Satb2的表達增加約2倍，成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osx和Runx2，及成骨特異性基因BSP及COLI表達顯著增加；而OC的表達雖然有增加，但與對照組相比差異沒有顯著性。實驗組BSP陽性細胞數(shù)高于對照組。
　　 術(shù)后3周，H&E染色結(jié)果顯示，種植體主要被骨組織包繞

16、，與種植體直接接觸的部位，主要為不同形態(tài)的骨組織，實驗組中種植體周圍的骨組織是排列規(guī)則的板層骨及少量的編織骨，與種植體直接接觸的區(qū)域也是礦化良好的骨組織；對照組中，與種植體直接接觸的骨組織中，局部有未完全礦化的細胞成分存在。3周時，實驗組中種植體周圍骨面積百分比高于對照組，宿主組織與種植體之間的結(jié)合主要為骨結(jié)合，實驗組中宿主與種植體發(fā)生骨結(jié)合的區(qū)域是對照組的約1.6倍。種植體植入3周時，實驗組中Satb2的表達仍顯著高于對照組，實驗組中

17、成骨相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Osx，Runx2及與成骨密切相關(guān)的BSP，COLI，OC的基因表達均明顯增加，與對照組相比差異具有顯著性。實驗組中BSP的陽性細胞數(shù)高于對照組。
　　 第三部分：1周時，GFP陽性的BMSCs分散位于種植體周圍的組織中，分布不均勻；3周時，在種植體周圍仍然可以檢測到GFP陽性的BMSCs存在；Satb2過表達的BMSCs在3周時促進了種植體的骨結(jié)合，并促進了種植體周圍新骨的形成。體內(nèi)外Real-time RT

18、-PCR結(jié)果基本一致，在3周時，種植體周圍組織中Satb2及成骨相關(guān)基因的表達仍然高于對照組，與第二部分3周時的結(jié)果相一致。
　　 結(jié)論：
　　 1.局部使用RCAS或pBABE-Hygro兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)，均可以以基因轉(zhuǎn)染的方法將Satb2轉(zhuǎn)入BSP-TVA轉(zhuǎn)基因小鼠股骨種植體周圍組織中，并在種植體的局部高表達Satb2。
　　 2.Satb2在種植體局部的高表達能夠促進種植體部位組織中成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄

19、因子Osx和Runx2的表達，同時提高了成骨特異性基因BSP，COLI及OC的表達；使用RCAS-Satb2逆轉(zhuǎn)錄病毒時，能夠顯著提高種植體1周時的骨結(jié)合；3周時，Satb2促進了種植體的骨結(jié)合并促進了種植體周圍新骨的形成。
　　 3.通過RCAS及pBABE-Hygro兩種不同的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達系統(tǒng)將Satb2應用于種植體的局部在種植體周圍組織的成骨機制中存在明顯的差異。兩組在種植體周圍組織中成骨機制的差異，可能與RCAS逆轉(zhuǎn)錄