靜電紡絲法制備成型PLGA-β-TCP納米纖維支架及其生物學(xué)性能研究.pdf

1、骨組織工程支架方面的研究中，當(dāng)前支架材料均有各自不足之處，獲得一種力學(xué)、生物學(xué)、形態(tài)學(xué)等方面均“完美”的理想支架材料是目前的研究熱點。各種材料中以聚乳酸羥基乙酸（PLGA）為代表的有機高分子生物材料因其較好的可塑成形性、可降解吸收性以及良好的生物相容性等優(yōu)點，應(yīng)用最為廣泛。而為了克服單純PLGA材料支架機械強度不足、細(xì)胞吸附力弱、降解時間偏長等缺點，本研究期望通過向PLGA中加入具有細(xì)胞誘導(dǎo)吸附力強、機械強度較高、降解較快的β磷酸三鈣（

2、β-Tricalcium poosphate，β-TCP），在冷凍干燥（Freeze-drying，F(xiàn)D）技術(shù)制成的形狀可塑殼聚糖/明膠內(nèi)核外表面，采用靜電紡絲（Electrospinning，ES）立體包覆PLGA/β-TCP納米纖維，從而生產(chǎn)出宏觀結(jié)構(gòu)可塑、微觀三維孔隙結(jié)構(gòu)豐富、成骨細(xì)胞親和性佳、降解時間適宜的新型復(fù)合材料支架。
　　研究方法：
　　1.分別以10組不同質(zhì)量比的PLGA和β-TCP為溶質(zhì)（質(zhì)量比分別為10

3、：0、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、0：10），以體積比為2：1的三氯甲烷/丙酮混合液為溶劑，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12％的10組紡絲液。采用靜電紡絲技術(shù)（電壓12Kv，電極間距10cm）試制PLGA/β-TCP納米纖維。制備出來的PLGA/β-TCP納米纖維薄膜，采用接觸角測量儀測定不同組份的納米纖維親水性，液體置換法測定孔隙率，1％胰酶浸泡降解法測定降解性，從而選取親水性、孔隙率、降解時間各方面均

4、衡的PLGA/β-TCP配料比例。并利用掃描電鏡觀查纖維薄膜的微觀孔隙結(jié)構(gòu)。
　　2.以殼聚糖和明膠質(zhì)量比為1：1的混合物為溶質(zhì)，1％醋酸為溶劑，混勻后-80℃冷凍干燥，制備出外觀質(zhì)地均勻、富含三維多孔隙結(jié)構(gòu)的內(nèi)核載體（可根據(jù)實際需要修裁外型）。將該內(nèi)核載體置于靜電紡絲接受電極端，以質(zhì)量比為7：3的PLGA/β-TCP復(fù)合納米纖維噴涂包裹于外，制得最終成型的PLGA/β-TCP納米纖維支架。
　　3.根據(jù)相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)

5、準(zhǔn)，采用體外細(xì)胞毒性試驗（GB/T16886.5-2003）和溶血試驗（YY/T0127.1-1993）評價成型PLGA/β-TCP納米纖維支架生物安全性。
　　4.酶消化法獲取SD仔鼠原代成骨細(xì)胞，分別與殼聚糖/明膠支架、PLGA納米纖維支架、PLGA/β-TCP納米纖維支架進行體外孵育培養(yǎng)，短時間培養(yǎng)為30min、60min和120min三個時間點，共孵育穩(wěn)定1天后，取出支架在無細(xì)胞血清培養(yǎng)基中再培養(yǎng)4d和8d。分別采用MTT

6、（四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)）法檢測粘附于支架上的細(xì)胞新陳代謝活性，并利用掃描電鏡（SEM）觀察支架上細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量及生物學(xué)形態(tài)。
　　結(jié)果：
　　1.PLGA與β-TCP質(zhì)量比為10：0、9：1、8：2、7：3的4組可制得納米纖維，其余6組產(chǎn)物為細(xì)粉粒狀物，無法制得具有連續(xù)性的納米纖維，不能形成網(wǎng)狀三維結(jié)構(gòu)，因而不符合試驗要求。
　　2.在可制成納米纖維的4組中，隨著PLGA/β-TCP混合材料中β-TCP比例的增加，

7、所得納米纖維材料的親水性能逐漸降低，孔隙密度逐漸增加，整體降解速度逐漸增快。故PLGA與β-TCP質(zhì)量比為7：3時所獲得的PLGA/β-TCP納米纖維材料最為理想。
　　3.細(xì)胞毒性實驗表明該種成型PLGA/β-TCP支架無細(xì)胞毒性，溶血試驗結(jié)果顯示其溶血率小于5％，具有良好的血液相容性和生物安全性。
　　4.培養(yǎng)30min、60min和120min后，MTT實驗表明，共孵育同等時長時PLGA/β-TCP納米纖維支架上粘附的

8、成骨細(xì)胞吸光值最高，殼聚糖/明膠組次之，PLGA納米纖維支架組最低。SEM觀察到PLGA/β-TCP納米纖維支架上粘附的成骨細(xì)胞數(shù)量最多，殼聚糖/明膠組次之，PLGA納米纖維支架組較少。
　　5.成骨細(xì)胞共孵育1d后，各組MTT值無統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05），SEM照片顯示各組中成骨細(xì)胞粘附良好，開始鋪展生長。在4d和8d時，PLGA/β-TCP組MTT值均高于PLGA和殼聚糖/明膠組（p＜0.05）。SEM照片顯示各組中成骨細(xì)胞

9、狀態(tài)良好，平鋪層疊生長，可見細(xì)胞偽足向孔洞內(nèi)部生長，開始遷移，且PLGA/β-TCP組中細(xì)胞數(shù)量明顯多于PLGA和殼聚糖/明膠組。
　　結(jié)論：
　　采用質(zhì)量比為7：3的PLGA/β-TCP混合紡絲液，利用靜電紡絲技術(shù)可制得三維孔隙結(jié)構(gòu)豐富、成骨細(xì)胞吸附性強、降解時間適宜的納米纖維，輔以凍干法制備的殼聚糖/明膠可塑性內(nèi)核，制得較為理想的PLGA/β-TCP納米纖維支架。該支架具有可靠的生物安全性和良好的細(xì)胞相容性，同時還具有外