半乳糖凝集素-3在舌癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、山東大學(xué)博士學(xué)位論文半乳糖凝集素3在舌癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究姓名：張東申請學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：口腔臨床醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：魏奉才20120906JJ東大學(xué)博士學(xué)位論文2將液氮保存的舌癌細(xì)胞SCC4和CAL27于37。C水浴中快速溶化，用預(yù)冷的培養(yǎng)基混勻已融化的腫瘤細(xì)胞懸液，在4℃下1800rpm離心10min。棄上清，重懸細(xì)胞于新鮮培養(yǎng)液中，SCC4采用RPMI1640，CAL27采用高糖DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞

2、用于實(shí)驗(yàn)。3采用陽離子脂質(zhì)體法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，按照Invitrogen公司LipofectamineTMRNAiMAX試劑說明書操作，分別將contr01siRNA和Gal3siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，空白對(duì)照組細(xì)胞不做任何處理。37。C，5％C02條件下培養(yǎng)6h后，替換為含血清的生長培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后48h，對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為以及相關(guān)因子的表達(dá)進(jìn)行檢測。4轉(zhuǎn)染后48h收集各組細(xì)胞，采用Tri

3、zol法提取總RNA。采用TIANGEN公司QuantscriptRTKit試劑盒，取模板RNA1肛g，加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，合成cDNA第一鏈。應(yīng)用TIANGEN公司ReaIMasterMix(SYBRGreen)試劑盒，以1glcDNA為模板，在7500RealTimePCRSystem中進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用SequenceDetectbnSoftwareversion14對(duì)Gal3的表達(dá)進(jìn)行分析。以B肌動(dòng)蛋白(3actin)作為內(nèi)參照。引

4、物序列為：Gai3上游引物5’GGCCACTGATTGTGCCTIAT3’，下游引物5’一T(論AACCTTG從GTGGTCAG3’；3actin上游引物5’一CTCCTC—CTGAGCGCAAGTACTC3’，下游引物5’一TCCTGCTTGCTGATCCACATC3’。5轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞，用RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取50嶺蛋白上樣，12％SDS—PAGE膠垂直電泳后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用5％脫

5、脂奶粉封閉過夜，加入1：1000兔抗人Gal3多克隆抗體，4“C反應(yīng)過夜，TBST洗膜，加入1：2000辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育2h，ALP顯色。掃描、分析Gab3蛋白的表達(dá)。以3actin作為內(nèi)參照。6采用MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)約為20103。37℃，5％C02條件下過夜，細(xì)胞達(dá)到鋪滿30～50％時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。分別于轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h和72h在每孔加入CCK810gl，繼續(xù)常