TMEM63A在捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)半乳糖結(jié)合凝集素調(diào)節(jié)山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞功能中的作用.pdf

1、捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)是牛羊等反芻動(dòng)物重要的腸道寄生性線蟲(chóng)。它寄生在牛羊等宿主動(dòng)物真胃及小腸內(nèi)，靠吸食宿主血液為生。感染捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)能夠引起宿主免疫功能低下，造成宿主貧血、消瘦及死亡，死亡多發(fā)生于羔羊。給世界范圍內(nèi)畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
　　Hco-gal-m(Acc.No.AY253330)和Hco-gal-f(Acc.No.AY253331)是由本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)，分離，體外克隆表達(dá)的，分別來(lái)自于捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)的半乳糖結(jié)合凝集素

2、。本實(shí)驗(yàn)室目前研究表明，重組Hco-gal-m/f(rHco-gal-m/f)能夠以劑量依賴方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞遷移能力，減少氧自由基釋放，降低NO產(chǎn)量和細(xì)胞因子水平。當(dāng)用rHco-gal-m/f免疫山羊時(shí)，會(huì)出現(xiàn)糞便內(nèi)蟲(chóng)卵量降低，山羊體內(nèi)蟲(chóng)體減少，IgG水平上升等變化。而跨膜蛋白63A(TMEM63A)是Ⅳ型跨膜蛋白。進(jìn)一步研究證明，TMEM63A在大多數(shù)山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞上表達(dá)，參與細(xì)胞因子調(diào)節(jié)。然而，目前TMEM63A只在

3、為數(shù)不多的幾種哺乳動(dòng)物上發(fā)現(xiàn)，其功能均未知。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TMEM63A是捻轉(zhuǎn)血矛線蟲(chóng)半乳糖結(jié)合凝集素在山羊外周血單個(gè)核細(xì)胞上的受體或結(jié)合蛋白。本文使用抗體封閉技術(shù)、RNA干擾技術(shù)研究TMEM63A對(duì)Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs（單核細(xì)胞）增殖、遷移、吞噬以及NO分泌功能的影響。
　　1.TMEM63A-Ⅰ原核克隆表達(dá)
　　由于TMEM63A是一個(gè)多次跨膜蛋白，且疏水性較強(qiáng)，不能以整體的形式在原核表達(dá)系統(tǒng)

4、中表達(dá)。我們選擇TMEM63A最長(zhǎng)膜內(nèi)區(qū)片段TMEM63A-Ⅰ作為目的片段進(jìn)行克隆表達(dá)。TMEM63A-Ⅰ全長(zhǎng)648bp。對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)信息分析，發(fā)現(xiàn)此片段疏水性較弱，有B細(xì)胞作用位點(diǎn)。首先將TMEM63A-Ⅰ重組進(jìn)入pMD18-T載體，用以TMEM63A-Ⅰ基因片段保存。經(jīng)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)載體中TMEM63A-Ⅰ基因片段與NCBI中該片段同源性達(dá)100％。隨后，構(gòu)建表達(dá)載體pET-28a-TMEM63A-Ⅰ，并將其轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21，

5、構(gòu)建表達(dá)菌株BL21-pET-28a-TMEM63A-Ⅰ。用IPTG誘導(dǎo)5h，收集菌液。SDS-PAGE分析顯示，表達(dá)蛋白25KD大小，存在于包涵體中。用鎳柱純化蛋白。
　　2.多克隆抗體制備
　　用腸激酶切去純化后蛋白上的載體標(biāo)簽，收集無(wú)標(biāo)簽純化蛋白，測(cè)濃度后分裝保存。用無(wú)標(biāo)簽純化蛋白與弗氏佐劑混成乳濁液，多次免疫大鼠。收集免疫大鼠血清，用飽和硫酸銨純化法純化多克隆抗體anti-63-IP。用免疫共沉淀方法驗(yàn)證多克隆抗體a

6、nti-63-IP的特異性。Western blot結(jié)果顯示，anti-63-IP能夠特異性識(shí)別天然構(gòu)象TMEM63A。用間接ELISA方法檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)。
　　3.TMEM63A在Hco-gal-m/f調(diào)節(jié)PBMCs功能中的影響
　　抗體封閉技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單獨(dú)用40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs（或單核細(xì)胞）共孵育，同單獨(dú)細(xì)胞對(duì)照組相比，PBMCs（或單核細(xì)胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力被抑制

7、。說(shuō)明Hco-gal-m/f可以抑制PBMCs（或單核細(xì)胞）的增殖能力、NO分泌能力和遷移能力。用濃度為2ug/mL的TMEM63A特異性抗體anti-63A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與PBMCs（或單核細(xì)胞）共孵育，同用40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比，PBMCs（或單核細(xì)胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能力明顯提高，但與單獨(dú)細(xì)胞對(duì)照組相比，PBMCs（或單核細(xì)胞）的增殖能力、NO分泌能力、遷移能

8、力變化不明顯。用濃度為2ug/mL的非特性性抗體Neg A IgG和40μg/mLHco-gal-m/f與細(xì)胞共孵育，同40μg/mLHco-gal-m/f共孵育組相比，細(xì)胞增殖能力、吞噬能力、NO分泌能力、遷移能力無(wú)顯著改變。說(shuō)明特異性抗體anti-63A IgG可以阻斷Hco-gal-m/f與受體TMEM63A的結(jié)合，進(jìn)而阻斷Hco-gal-m/f對(duì)細(xì)胞功能的影響。RNA干擾技術(shù)研究結(jié)果顯示，用特異性TMEM63A干擾RNATMEM