天南星凝集素和石蒜凝集素基因的克隆及抗蟲研究

1、復(fù)且大學(xué)博士掌位論文摘要利用基因工程培育抗病蟲作物是抗性育種重要的現(xiàn)代化手段。研究表明一些植物凝集素對多種害蟲尤其是對同翅目類害蟲有較強(qiáng)的抗性。為了更多的對植物凝集素基因進(jìn)行研究，以天南星和石蒜為材料，利用RACE—PCR克隆技術(shù)，成功克隆出了它們的凝集素基因。通過相關(guān)的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)出的氨基酸序列與石蒜科、蘭科以及天南星科其它植物的凝集素基因有很高的同源性，為甘露糖特異結(jié)合的凝集素基因。為了研究天南

2、星凝集素AHA的功能，構(gòu)建了AHA的原核表達(dá)體系。將編碼天南星凝集素成熟蛋白的基因序列構(gòu)建到了原核表達(dá)載體pQE30中，通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15菌株，在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出了目的蛋白，并對目的蛋白進(jìn)行了純化。將純化的蛋白加入到人工飼養(yǎng)液中飼喂蚜蟲，發(fā)現(xiàn)純化的天南星凝集素蛋白有抗蟲活性，能抑制蚜蟲的生存和繁殖。為了研究天南星凝集素基因在利用基因工程技術(shù)培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物中的潛在應(yīng)用價(jià)值，構(gòu)建了含天南星凝集素基因(aha)的植物表達(dá)載體pB

3、ll21一AHA，利用凍融法將載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌菌株EHAl05中。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法，將aha轉(zhuǎn)入煙草中，在誘導(dǎo)生根移栽后對煙草檀株進(jìn)行了一系列的分子檢測。并對部分PCR陽性植株進(jìn)行了Southernblot和Northernblot雜交檢測。Southernblot雜交結(jié)果顯示天南星凝集素基因已經(jīng)整合到了煙草的基因組中，Northernblot結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草成功表達(dá)了天南星凝集素基因。對表達(dá)AIA的轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲(

4、蚜蟲)分析表明，轉(zhuǎn)基因植株對蚜蟲具有明顯抗性，能有效抑制蚜蟲的生存和繁殖。通過研究，證實(shí)了天南星凝集素對同翅目類的害蟲如蚜蟲具有抗性。植物凝集素基因是一類有廣闊應(yīng)用價(jià)值的抗蟲基因。研究結(jié)果表明通過轉(zhuǎn)植物凝集素基因的途徑得到抗蟲性的一些植物品種是可行的。關(guān)鍵詞：天南星凝集素(Arisaemaheterophyllumagglutinin，AHA)，石蒜凝集素(Lycorisradiataagglutinin，LRA)，RACE，遺傳轉(zhuǎn)化，

5、重組蛋白，抗蟲分析復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文tohomopteranpestssuchasaphids，TheahagenethusrepresentsapromisingcandidatetobeusedingeneticengineeringforenhancedinsectresistanceandmaymakeavaluablecontributiontocropprotectionKeywords：Arfsaemaheterophy