高遷移率族蛋白B1(HMGB1)與血栓閉塞性脈管炎的相關(guān)性及HMGB1 A Box對(duì)其保護(hù)機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和研究目的:
　　 血栓閉塞性脈管炎(thromboangitis obilterans，TAO)是一種以中小動(dòng)靜脈慢性節(jié)段性病變?yōu)橹鞯难仔蚤]塞性疾病，其主要侵襲四肢，尤其是下肢的中小動(dòng)脈靜脈，引起患肢遠(yuǎn)端缺血性病變。該病在各種族中均有發(fā)病，在歐洲它占到所有住院動(dòng)脈閉塞性疾病的5％，而在日本則上升為16％?；颊叨酁榍鄩涯昴行?，絕大多數(shù)有吸煙史。其病程呈進(jìn)展性，常表現(xiàn)為間歇性跛行、靜息痛、潰瘍及血栓性淺靜脈炎等，患者生活質(zhì)

2、量受到嚴(yán)重影響，甚至面臨截肢。已有研究顯示血栓閉塞性脈管炎患者的動(dòng)脈內(nèi)膜中粘附因子血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、E選擇素、腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)明顯增多，炎細(xì)胞浸潤(rùn)并且內(nèi)膜明顯增厚，因此將其定義為炎性疾病。盡管對(duì)其病因、病程進(jìn)展、治療等方面進(jìn)行了大量研究，但關(guān)于血栓閉塞性脈管炎的機(jī)制仍然沒(méi)有完全闡明，目前尚無(wú)有效治療方法。
　　 高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是為一種重

3、要的炎癥介質(zhì)和致炎細(xì)胞因子。當(dāng)細(xì)胞活化或死亡時(shí)，HMGB1可被壞死或受損細(xì)胞被動(dòng)釋放至胞外，與其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)和/或TOLL樣受體結(jié)合傳遞胞內(nèi)信號(hào)并介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)，包括趨化細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、釋放促炎因子及粘附因子，它是啟動(dòng)和維持炎癥瀑式反應(yīng)的中心分子，HMGB1在多種炎癥病理中作為一種信號(hào)傳導(dǎo)和放大因素，可以增強(qiáng)炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，延長(zhǎng)炎癥病理過(guò)程。目前發(fā)現(xiàn)在膿毒血癥、急性胰腺炎及一些無(wú)菌性炎癥包括關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、缺血再灌注損

4、傷的患者血清及組織中HMGB1水平明顯升高。同時(shí)已有研究表明HMGB1參與動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死等多種心血管疾病并介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，HMGB1與內(nèi)皮細(xì)胞共孵育能以時(shí)間依賴的方式增加ICAM-1、VCAM-1及RAGE的表達(dá)，促使TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白(MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)分泌，并可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞釋放纖溶酶原激活物抑制物-1(PAI-1)引起血小板變形。但HMGB1在血栓閉塞性脈管炎的作用目前未見(jiàn)報(bào)道。
　

5、　 HMGB1自身有A和B兩個(gè)DNA模體，結(jié)構(gòu)功能分析顯示其活化細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)域定位在B盒子上，而A盒子競(jìng)爭(zhēng)HMGB1的結(jié)合位點(diǎn)，減弱HMGB1全長(zhǎng)的生物效應(yīng)。現(xiàn)有研究表明HMGB1內(nèi)源性抑制劑重組HMGB1 Abox(rAbox)可以競(jìng)爭(zhēng)性抑制HMGB1的促炎作用，在多種炎性動(dòng)物模型中起到保護(hù)作用。
　　 鑒于血栓閉塞性脈管炎的炎性病變基礎(chǔ)及HMGB1在介導(dǎo)炎癥及內(nèi)皮損傷過(guò)程中的重要性，本論文中我們通過(guò)建立大鼠血栓閉塞性脈管

6、炎模型，研究了HMGB1與血栓閉塞性脈管炎的關(guān)系，探討HMGB1內(nèi)源性抑制劑重組HMGB1 Abox對(duì)于血栓閉塞性脈管炎大鼠的影響及相關(guān)分子機(jī)制，為明確血栓閉塞性脈管炎的發(fā)病機(jī)制和尋找有效治療措施提供理論依據(jù)。
　　 研究?jī)?nèi)容:
　　 1.建立大鼠血栓閉塞性脈管炎模型;
　　 2.研究HMGB1及其受體RAGE是否參與血栓閉塞性脈管炎發(fā)展;
　　 3.抑制HMGB1，能否抑制血栓閉塞性脈管炎病情進(jìn)展;

7、r>　　 4.分析HMGB1參與血栓閉塞性脈管炎發(fā)展及其內(nèi)源性抑制劑減緩血栓閉塞性脈管炎病情進(jìn)展的相關(guān)機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 1.動(dòng)物處理:股動(dòng)脈注射月桂酸建立大鼠血栓閉塞性脈管炎模型，對(duì)照組注射等劑量的生理鹽水，治療組采用腹腔注射不同劑量重組HMGB1 Abox觀察其療效。
　　 2.大鼠患肢體征變化的觀察:術(shù)后每日觀察患肢的大體表現(xiàn)，術(shù)后15天參照日本學(xué)者M(jìn)urakami提出的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)級(jí)。

8、　　 4.收集組織:處理結(jié)束后，收集大鼠股動(dòng)脈、血液備用。
　　 5.組織形態(tài)學(xué)分析:蘇木精-伊紅染色，觀察管壁結(jié)構(gòu)及血管通暢性，計(jì)算血管腔內(nèi)血栓面積。
　　 6.血液學(xué)檢測(cè):收集大鼠血液行血細(xì)胞計(jì)數(shù)及凝血指標(biāo)檢測(cè)。
　　 7.血漿中蛋白水平的分析:利用試劑盒檢測(cè)血漿中HMGB1、血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α(6-K-PGF1α)蛋白水平。
　　 8.股動(dòng)脈中蛋白水平的分析:
　

9、　 1)用免疫組織化學(xué)法結(jié)合激光掃描共聚焦顯微術(shù)，檢測(cè)HMGB1及其受體晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)在血管壁中蛋白表達(dá)水平及分布。
　　 2)用Westem blot方法，檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。
　　 9.股動(dòng)脈中炎性因子及粘附因子蛋白水平的分析:
　　 1)用免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)炎性因子白介素-6(IL-6)、粘附因子血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子-1(VCAM-1)和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)的蛋白表達(dá)水

10、平及分布。
　　 2)用Western blot方法，檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平。
　　 10.股動(dòng)脈中基因水平的分析:利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR術(shù)，檢測(cè)動(dòng)脈中HMGB1、RAGE、IL-6、VCAM-1、ICAM-1的mRNA水平。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.利用股動(dòng)脈注射月桂酸法成功建立大鼠血栓閉塞性脈管炎模型
　　 1.1注射月桂酸15天后，模型組大鼠呈現(xiàn)血栓閉塞性脈管炎的典型癥狀和體征。
　　

11、 1.2 HE染色顯示:動(dòng)脈壁炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腔內(nèi)血栓形成，管腔狹窄幾近閉塞。
　　 2.HMGB1及其受體RAGE參與了血栓閉塞性脈管炎的發(fā)展
　　 2.1我們檢測(cè)了各組動(dòng)物血漿中HMGB1蛋白變化。模型組血漿中HMGB1的蛋白水平較正常組及假手術(shù)組明顯升高(p＜0.01)，正常組及假手術(shù)組之間沒(méi)有顯著差異。
　　 2.2對(duì)各組動(dòng)物股動(dòng)脈組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色和雙染免疫熒光染色發(fā)現(xiàn):模型組中HMGB1主要在

12、內(nèi)膜及中膜的胞質(zhì)中表達(dá)，其受體RAGE主要主要在內(nèi)膜中表達(dá)。模型組股動(dòng)脈中HMGB1及其受體RAGE的蛋白水平較正常組及假手術(shù)組明顯升高。
　　 2.3對(duì)各組動(dòng)物股動(dòng)脈組織進(jìn)行Western Blot和PCR分析發(fā)現(xiàn):模型組股動(dòng)脈中HMGB1及其受體RAGE的蛋白及mRNA水平較正常組及假手術(shù)組明顯升高(p＜0.01)
　　 3.抑制HMGB1能夠抑制血栓閉塞性脈管炎病情進(jìn)展
　　 3.1處理結(jié)束后對(duì)各組大鼠根據(jù)

13、Murakami分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)級(jí)結(jié)果顯示模型組病變等級(jí)較假手術(shù)組明顯升高，腹腔注射低劑量及高劑量重組HMGB1 A box均明顯降低血栓閉塞性脈管炎病變等級(jí)。
　　 3.2 HE染色顯示:低劑量重組HMGB1 A box減低，高劑量重組HMGB1 A box明顯降低血栓閉塞性脈管炎模型中股動(dòng)脈血栓面積(p＜0.05)。
　　 3.3 ELISA結(jié)果顯示:低劑量重組HMGB1 A box抑制血漿中HMGB1表達(dá)。高劑量重組HM

14、GB1 A box顯著降低血漿中HMGB1表達(dá)(p＜0.05)。
　　 3.4處理各組動(dòng)物股動(dòng)脈組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、雙染免疫熒光染色、Western Blot和PCR結(jié)果顯示:低劑量重組HMGB1 A box抑制血管壁中HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達(dá)水平。高劑量重組HMGB1 Abox顯著抑制血管壁中HMGB1、RAGE蛋白及mRNA表達(dá)水平。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明重組HMGB1 A box通過(guò)抑制HMGB1及RAGE表

15、達(dá)減緩病情進(jìn)展并呈劑量依賴性。
　　 4.HMGB1參與血栓閉塞性脈管炎病情發(fā)展及重組HMGB1 A box保護(hù)機(jī)制的研究
　　 4.1模型建立成功后，我們對(duì)各組動(dòng)物股動(dòng)脈組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn):模型組血管壁中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和ICAM-1的蛋白水平較正常組及假手術(shù)組明顯升高(p＜0.05)，正常組及假手術(shù)組之間無(wú)明顯差異。
　　 4.2股動(dòng)脈組織進(jìn)行Western Blot和PC

16、R分析發(fā)現(xiàn):模型組股動(dòng)脈中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和ICAM-1的蛋白及mRNA水平較正常組及假手術(shù)組明顯升高(p＜0.05)。
　　 4.3應(yīng)用低劑量及高劑量重組HMGB1 A box腹腔注射后，免疫組織化學(xué)染色， Western Blot及PCR檢測(cè)結(jié)果顯示高劑量重組HMGB1 A box顯著抑制血管壁中炎性因子IL-6、粘附因子VCAM-1和ICAM-1蛋白及mRNA表達(dá)水平(p＜0.05)。
　　

17、4.4在血液學(xué)檢查中我們發(fā)現(xiàn)模型組中血小板計(jì)數(shù)(PLT)及纖維蛋白原(FIB)較正常組及假手術(shù)組明顯升高(p＜0.05)。凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)較正常組及假手術(shù)組明顯降低(p＜0.05)。而紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)在各組中未見(jiàn)明顯變化。
　　 4.5應(yīng)用重組HMGB1 Abox處理后，高劑量處理組血小板計(jì)數(shù)(PLT)及纖維蛋白原(FIB)較模型組明顯降低(p＜0.

18、05)。凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)較模型組明顯升高(p＜0.05)。低劑量重組HMGB1 Abox起到相同的作用，但效果較弱。
　　 4.6血栓素B2(TXB2)、6-酮-前列腺素F1α（6-K-PGF1α）分別是血栓素A2(TXA2)和前列環(huán)素(PGI2)的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物，兩者分別誘導(dǎo)和抑制血小板聚集。對(duì)各組動(dòng)物血漿行ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn):模型組血漿中6-K-PGF1α較正常組及假手

19、術(shù)組明顯降低(p＜0.05);而TXB2及TXB2/6-K-PGF1α明顯升高(p＜0.05)。在應(yīng)用低劑量和高劑量重組HMGB1 Abox處理后血漿中6-K-PGF1α水平明顯升高(p＜0.05);TXB2及TXB2/6-K-PGF1α明顯降低(p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.HMGB1及其受體RAGE參與月桂酸誘導(dǎo)的大鼠血栓閉塞性脈管炎模型中。
　　 2.HMGB1抑制劑重組HMGB1 Abox能夠