結(jié)締組織生長因子在糖尿病腎病發(fā)病中的作用及己酮可可堿對(duì)其表達(dá)影響的研究.pdf

1、目的：轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）被認(rèn)為是糖尿病腎?。―N）致纖維化因子中最為重要的一個(gè)，在介導(dǎo)DN的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用，但是TGF-β強(qiáng)大的抗炎抗腫瘤效應(yīng)限制了其作為DN治療靶點(diǎn)的應(yīng)用。結(jié)締組織生長因子（CTGF）作為TGF-β重要的下游效應(yīng)分子介導(dǎo)了TGF-β的致纖維化作用而并不介導(dǎo)其抗炎抗腫瘤的有利作用，這就使得CTGF成為DN治療的最佳干預(yù)位點(diǎn)。因此研究TGF-β-CTGF通路、探討CTGF在DN發(fā)生發(fā)展中的重要作用及尋找

2、可以抑制CTGF表達(dá)而對(duì)TGF-β表達(dá)沒有影響的藥物，對(duì)于研究DN的干預(yù)治療有重要意義。本課題應(yīng)用體外培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞的方法來研究高糖誘導(dǎo)CTGF表達(dá)的機(jī)制及糖尿病大鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究CTGF在介導(dǎo)DN早期細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的聚積晚期腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化中發(fā)揮的重要作用并應(yīng)用己酮可可堿（PTX）干預(yù)探討CTGF作為DN治療靶點(diǎn)的研究意義。
　　 萬法:1.體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞，研究不同濃度的高糖（15mM和30mM）

3、在不同的刺激時(shí)間（24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)）對(duì)于系膜細(xì)胞TGF-β、CTGFmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)、P-Smad2/3、Smad7蛋白質(zhì)表達(dá)及纖粘連蛋白（FN）mRNA表達(dá)的影響，并在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入TGF-β中和抗體觀察CTGFmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)、FN表達(dá)的變化。2.以鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)糖尿病大鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用RT-PCR、免疫組化及western-blot等多種分子生物學(xué)方法從不同角度研究在糖尿病發(fā)展的不同時(shí)期（2w

4、、4w、8w、12w）腎皮質(zhì)中CTGF表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，并研究其與DN早期腎肥大、ECM的聚積及后期腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化之間的關(guān)系，同時(shí)以ELISA方法檢測糖尿病大鼠尿液中CTGF含量的變化。3.在高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞的培養(yǎng)液中加入不同濃度的PTX（0.1mM、0.3mM、1mM）觀察其對(duì)于TGF-β、CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，進(jìn)一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究PTX干預(yù)（50mg/Kg/d）對(duì)于糖尿病大鼠腎皮質(zhì)CTGF表達(dá)的影響及其對(duì)于DN的

5、治療意義。
　　 結(jié)果:1.高糖可以誘導(dǎo)系膜細(xì)胞TGF-β、CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)的增加（P<0.05），且呈時(shí)間劑量依賴性，同時(shí)伴有P-Smad2/3蛋白表達(dá)的增加及Smad?蛋白表達(dá)的減少，TGF-β的阻斷可以使高糖誘導(dǎo)的CTGFmRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)下降86.4％及91.8％（P<0.05）.2.糖尿病大鼠腎皮質(zhì)mRNA及CTGF蛋白質(zhì)的表達(dá)2w時(shí)開始增加，并隨著病程的發(fā)展逐漸增高，12w時(shí)達(dá)高峰（P<0.05）；其

6、表達(dá)升高早期出現(xiàn)在腎小球內(nèi)而后隨著病程的發(fā)展亦出現(xiàn)于腎小管間質(zhì)區(qū)域。相關(guān)性分析顯示CTGF的表達(dá)與TGF-β的表達(dá)、腎指數(shù)、腎小球體積、系膜基質(zhì)指數(shù)、腎小管間質(zhì)纖維化程度成正相關(guān)（P<0.05）；糖尿病大鼠尿液中CTGF的含量隨著病程的發(fā)展逐漸升高（P<0.05），與24小時(shí)尿μMA、BUN、Cr成正相關(guān)。3.0.3mM的PTX可以使高糖誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)下降31.5％，蛋白質(zhì)表達(dá)下降18.6％；隨著PTX濃度的進(jìn)一步增

7、加其抑制CTGF表達(dá)的效果更為顯著，1mMPTX分別使CTGFmRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)下降80.8％及68.9％（P<0.05），但是對(duì)于TGF-β的mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)均沒有明顯影響（P>0.05）；在糖尿病大鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中PTX的干預(yù)可以使腎臟皮質(zhì)中CTGFmRNA表達(dá)及蛋白質(zhì)表達(dá)低于同時(shí)期DM組，而且這種抑制作用從2W開始一直持續(xù)到12w，在2w、4w、8w、12w可以分別使CTGF蛋白質(zhì)表達(dá)下降98.8％、87.8％、72.4％、

8、79.1％（P<0.05），而對(duì)于TGF-β而言在2w、4w、8w時(shí)PTX并不能使其表達(dá)發(fā)生明顯變化（P>0.05），而在12w時(shí)PTX組的TGF-β表達(dá)要低于同時(shí)期DM組（P<0.05）。
　　 結(jié)論:1.高糖主要通過TGF-β-Smads通路使CTGFmRNA表達(dá)增加進(jìn)而影響其蛋白質(zhì)水平表達(dá)。2.CTGF在DN發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，CTGF表達(dá)的增加貫穿了DN發(fā)病的整個(gè)過程，早期介導(dǎo)了腎肥大，腎小球ECM的積聚，晚期