miR-155在糖尿病腎病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、目的：近年來，隨著全球范圍內(nèi)糖尿病發(fā)病率的不斷增加，在西方國家，糖尿病腎?。―iabetic Nephropathy，DN）已成為導(dǎo)致終末期腎臟?。‥nd-stage renal disease。ESRD）的首要病因，也是引起糖尿病患者死亡的主要原因。在我國，這一比例也在逐年遞增。腎小球肥大是DN最為突出的早期表現(xiàn)，系膜基質(zhì)增多、系膜區(qū)增寬，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）異常積聚及由此導(dǎo)致的腎小球硬化和腎

2、小管間質(zhì)纖維化是DN進(jìn)展的關(guān)鍵特征。然而，迄今為止，DN的發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚，現(xiàn)有的治療手段尚不足，因此，探討DN的發(fā)病機(jī)制、尋找DN新相關(guān)致病基因，將對臨床預(yù)防、診斷和治療DN具有重要意義。microRNA(miRNA)是人類新近發(fā)現(xiàn)的一類長約21~24bp的內(nèi)源性、非編碼單鏈小RNA，通過與靶mRNA的3＇端非翻譯區(qū)(3＇-UTRs)序列配對互補(bǔ)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平引起靶mRNA降解和（或）蛋白翻譯抑制而參與生物體的多種生理及病理過

3、程。血清、血漿、尿液等多種體液中發(fā)現(xiàn)的miRNA是細(xì)胞外miRNA的特殊存在方式，具有體液循環(huán)中的穩(wěn)定性、細(xì)胞間的穿梭性以及不同組織來源的特異性等特點(diǎn)，使得體液miRNA有望作為一種新的生物標(biāo)志物，從而有助于疾病的早期診斷、臨床療效及預(yù)后狀況的評估。目前，已有大量的研究報(bào)道，多種miRNA與DN的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。然而，其參與DN發(fā)病的具體病理機(jī)制尚不十分明確，仍需有待于進(jìn)一步研究。在課題組前期研究中，通過miRNA芯片、RT-PCR

4、等方法對2型DN患者血清miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-155在DN患者血清中的表達(dá)水平顯著異常，提示miR-155可能與DN發(fā)病有關(guān)。應(yīng)用生物信息學(xué)方法，并結(jié)合文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)miR-155的目標(biāo)靶基因?yàn)檗D(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子-1（ETS1），后者在基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）參與基質(zhì)調(diào)控中起關(guān)鍵性作用。為此，本研究選擇糖尿病腎病背景下的db/db小鼠，通過動態(tài)觀察miR-155及其靶基因ETS1在DN小鼠血清或腎組織中的表達(dá)變化，以探討DN發(fā)展過

5、程中miR-155與ETS1和腎組織病理學(xué)特征的關(guān)系。
　　方法：選取4周齡的2型糖尿病腎病db/db小鼠（實(shí)驗(yàn)組），同周齡db/m小鼠（對照組）作為實(shí)驗(yàn)動物對象，分別檢測各組、各時(shí)段小鼠血清miR-155、腎組織miR-155和靶基因ETS1的動態(tài)表達(dá)變化，并明確分析miR-155與腎組織病理學(xué)特征和臨床生化指標(biāo)的相關(guān)性。⑴生化指標(biāo)檢測每周監(jiān)測小鼠的隨機(jī)血糖，在4、8、12、16周齡時(shí)，隨機(jī)抽取對照組和模型組小鼠各5只，記錄各組

6、小鼠體重（BW），留取血標(biāo)本和24h尿液，并檢測血肌酐（Scr)、尿素氮（BUN）和24h尿蛋白量（UAE）變化。⑵腎臟組織形態(tài)學(xué)觀察通過HE、PASM和Masson染色，光鏡下觀察各組小鼠腎組織的病理學(xué)改變，以明確db/db小鼠DN的病理進(jìn)展過程。⑶miR-155和ETS1mRNA的表達(dá)采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法檢測兩組小鼠血清miR-155、腎組織miR-155和靶基因ETS1表達(dá)的動態(tài)變化。⑷ETS1蛋白的表達(dá)采用免疫組織化學(xué)

7、染色法觀察靶蛋白ETS1在各組、各時(shí)段小鼠腎臟組織的表達(dá)和分布情況。
　　結(jié)果：①db/db小鼠生化指標(biāo)變化4周齡db/db小鼠出現(xiàn)肥胖，BW增加（P<0.05），而Glu、Scr、BUN及UAE水平雖有所升高，但與db/m對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。8周齡時(shí)，db/db小鼠BW、Glu、Scr和BUN均明顯增高（P<0.05，P<0.01），并出現(xiàn)了蛋白尿，說明此時(shí)db/db小鼠已發(fā)生DN。此后，隨周齡的增加

8、，db/db小鼠Glu、Scr、BUN及UAE水平進(jìn)一步增高（P<0.05。P<0.01）。②db/db小鼠腎組織病理改變 HE、PASM和Masson染色顯示，不同周齡的db/m小鼠腎小球及系膜區(qū)未見明顯異常改變。db/db小鼠4周齡時(shí)，其腎臟未見明顯異常，8周齡后，出現(xiàn)腎小球肥大、系膜細(xì)胞增多，伴毛細(xì)血管基底膜增厚。達(dá)16周齡時(shí)，可見腎小球與Bowman囊的壁層有黏連，出現(xiàn)病變腎小球系膜基質(zhì)增生和硬化，伴節(jié)段性腎小管擴(kuò)張、萎縮、腎間

9、質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤及纖維化形成。③db/db小鼠腎組織、血清miR-155表達(dá) RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與同周齡db/m相比，4周齡db/db小鼠的腎臟miR-155水平未見明顯變化（P>0.05），8周齡小鼠腎組織miR-155表達(dá)顯著高于同周齡的db/m小鼠，隨周齡的延長。miR-155表達(dá)明顯升高（P<0.05）。與腎臟中的表達(dá)結(jié)果相一致，8,12,16周齡db/db小鼠血清miR-155的表達(dá)均高于同周齡的db/m小鼠，且隨周齡

10、的延長，miR-155表達(dá)亦逐漸升高（P<0.05），而同周齡db/m小鼠則無明顯變化。④db/db小鼠腎組織ETS1mRNA表達(dá)與同周齡db/m小鼠相比，8、12及16周齡db/db小鼠腎臟ETS1mRNA表達(dá)明顯降低，且隨周齡的增加，ETS1mRNA的表達(dá)呈下降趨勢（P<0.05）。⑤db/db小鼠腎組織ETS1蛋白表達(dá)免疫組化染色顯示，ETS1主要定位于腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞。與同周齡db/m小鼠比較，4周齡db/

11、db小鼠腎臟中ETS1表達(dá)量未見明顯差異，但8周齡db/db小鼠腎組織ETS1表達(dá)減弱。隨周齡的增加，ETS1表達(dá)染色呈減弱趨勢。⑥db/db小鼠血清miR-155表達(dá)與生化指標(biāo)的相關(guān)性相關(guān)性分析顯示。db/db小鼠血清miR-155表達(dá)，分別與Scr、BUN、UAE的水平呈明顯相關(guān)性。
　　結(jié)論：⑴miR-155在db/db小鼠血清和腎組織中表達(dá)增高，并且隨DN的進(jìn)展，miR-155水平呈進(jìn)行性升高。提示miR-155可能參與了