人乳腺癌組織中D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度與VEGF-A、VEGF-C表達(dá)關(guān)系的研究.pdf

1、研究背景及目的：乳腺癌是一個(gè)復(fù)雜的全身性惡性疾病，研究表明乳腺癌組織生長(zhǎng)超過0.2cm～0.3cm大小時(shí)，在許多正負(fù)調(diào)控因子的相互作用下就開始了新生脈管的形成，供應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)所必需的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。但是至今乳腺癌誘導(dǎo)淋巴管生成的分子機(jī)制以及新生淋巴管與乳腺癌淋巴道轉(zhuǎn)移問的確切關(guān)系尚不甚明確。研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(Vascular endothelial growth factorA，VEGF-A)是目前已知的對(duì)血管生成起直接作用的重

2、要因子之一，能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和遷移，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(Vascular endothelial growth factor C，’VEGF-C)可能和腫瘤淋巴管生成有關(guān)，有望成為體內(nèi)重要的促淋巴管生成因子。新生的毛細(xì)血管與毛細(xì)淋巴管在許多方面極其相似，以往對(duì)腫瘤淋巴管生成的研究因?yàn)槿狈α馨凸軆?nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物，僅依靠普通的HE染色技術(shù)很難將它們?cè)谛螒B(tài)學(xué)上與毛細(xì)血管截然區(qū)分，因此對(duì)腫瘤新生淋巴管生成的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于對(duì)腫瘤新生血

3、管生成的研究。近年來，雖然血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體3(Vascular endothelialgrowth factor receptor3，VEGFR-3)、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(Lymphatic vesselcell edothelial hyaluronan receptor，LYVE-1)等一些淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但最近多項(xiàng)研究證實(shí)這些常用標(biāo)記物不僅在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而且在血管內(nèi)皮細(xì)胞中也有表達(dá)，影響了在形態(tài)學(xué)

4、上對(duì)腫瘤微淋巴管和腫瘤微血管的區(qū)分。1999年Marks等發(fā)現(xiàn)的D2-40分子是一種可以和胚胎睪丸細(xì)胞膜及干細(xì)胞膜表面的癌胚抗原M2A(一種分子量為40KD的O鏈-唾液酸糖蛋白)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。2006年最新的研究發(fā)現(xiàn)D2-40在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞上有固定的抗原決定簇，可以用來標(biāo)識(shí)惡性黑色素瘤、前列腺癌、胃癌、腎細(xì)胞癌等多種腫瘤的新生微淋巴管，在有管壁平滑肌的成熟淋巴管和微血管內(nèi)皮上沒有表達(dá)，因此其有望成為一種新的淋巴管內(nèi)皮

5、特異性標(biāo)記物。但應(yīng)用D2-40單抗標(biāo)記乳腺癌組織中微淋巴管的研究卻罕見報(bào)道。 本研究旨在對(duì)比CD31標(biāo)記的微血管，觀察乳腺癌組織中D2-40標(biāo)記的微淋巴管的形態(tài)及分布特征，通過半定量方法分析VEGF-C、VEGF-A在mKNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯水平上的表達(dá)情況及其與乳腺癌腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、P53和C-erbB-2等與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的臨床病理學(xué)因素之間的相關(guān)性，并進(jìn)一步探討D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度與VEGF-A、VEGF-C

6、的表達(dá)及乳腺癌腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為繼續(xù)研究乳腺癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和尋找更新的與乳腺癌患者生存有關(guān)的預(yù)后因子提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法：收集沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院2003年1月～2006年10月存檔的乳腺癌術(shù)后組織石蠟標(biāo)本102例和乳腺纖維腺瘤標(biāo)本25例。應(yīng)用免疫組化SP法及原位雜交方法檢測(cè)VEGF-A、VEGF-C的蛋白質(zhì)表達(dá)水平及VEGF-C mRNA的豐度，采用半定量方法進(jìn)行染色結(jié)果判斷及分析；應(yīng)用單標(biāo)免疫組化SP法及雙標(biāo)免疫組化法

7、(藍(lán)紫色的BCIP/NBT顯色系統(tǒng)和鮮紅色的AEC顯色系統(tǒng))檢測(cè)D2-40和CD31標(biāo)記的腫瘤新生脈管的的表達(dá)情況，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)D2-40陽(yáng)性微淋巴管密度(Lymphaticmicrovessels density，LMVD)。采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、x<'2>檢驗(yàn)、方差分析等統(tǒng)計(jì)分析。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：102例人乳腺癌組織中D2-40僅標(biāo)記于CD31陰性且管壁薄、形態(tài)不規(guī)則、管腔大小不一的微淋巴管上，在富含肌

8、層的成熟淋巴管和微血管上不表達(dá)。本組D2-40反應(yīng)陽(yáng)性率為76.5﹪(78/102)，中位LMVD為21.6(19.72±5.11)個(gè)微淋巴管/100倍視野，且瘤周組織LMVD顯著高于瘤內(nèi)(p=0.000)。按照乳腺癌腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目分層分析，腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和瘤周區(qū)域組織D2-40標(biāo)記微淋巴管密度相關(guān)(P<0.05)，腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目越多，D2-40陽(yáng)性的微淋巴管密度越大，而和瘤內(nèi)區(qū)域D2-40標(biāo)記的微淋巴管密度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(p>0

9、.05)。 免疫組化方法半定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)VEGF-A、VEGF-C蛋白主要表達(dá)于乳腺癌細(xì)胞的胞漿或胞膜及少量間質(zhì)脈管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，陽(yáng)性率分別為64.7﹪(66/102)和55.9﹪(57/102)，顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。VEGF-C mRNA的表達(dá)主要位于乳腺癌細(xì)胞的胞漿中，陽(yáng)性率為59.8﹪(61/102)，與其蛋白翻譯水平基本一致。VEGF-A在蛋白質(zhì)翻譯水平上的表達(dá)強(qiáng)度與乳腺癌大小、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和臨床分期有關(guān)(

10、P<0.05)，而與患者年齡、組織學(xué)分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)(P>0.05)：VEGF-C在mRNA轉(zhuǎn)錄豐度和蛋白質(zhì)翻譯水平上的表達(dá)強(qiáng)度均與乳腺癌乳腺癌大小、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有明顯相關(guān)性(P<0.05)。在乳腺癌組織中VEGF-A、VEGF-C的免疫組化表達(dá)強(qiáng)度及VEGF-CmRNA轉(zhuǎn)錄豐度與C-erbB-2、P53的表達(dá)強(qiáng)度相關(guān)(P<0.05)。 VEGF-C在蛋白及mRNA水平上的表達(dá)均與D2-40標(biāo)記淋巴管密度有顯著相關(guān)性(P

11、<0.05)，隨著VEGF-CmRNA轉(zhuǎn)錄豐度和VEGF-C蛋白質(zhì)表達(dá)豐度的增高，陽(yáng)性淋巴管密度也逐漸增加，腫瘤周圍管腔擴(kuò)張的功能型微淋巴管密度增加更明顯(P<0.05)。VEGF-A陽(yáng)性組也可見D2-40標(biāo)記陽(yáng)性微淋巴管表達(dá)，但淋巴管數(shù)目較少，尚不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)論：在人乳腺癌中，新近發(fā)現(xiàn)的單克隆抗體D2-40標(biāo)記的瘤周微淋巴管密度與乳腺癌腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目相關(guān)(P<0.05)，其有望成為人乳腺癌組織微淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。

12、對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的半定量分析發(fā)現(xiàn)人乳腺癌中VEGF-C的mRNA轉(zhuǎn)錄豐度與其蛋白質(zhì)翻譯水平相大致相同(59.8﹪和55.9﹪)，且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示VEGF-A蛋白表達(dá)率、VEGF-C蛋白表達(dá)率及mRNA轉(zhuǎn)錄豐度與乳腺癌腫塊大小、腋淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、臨床分期等與乳腺癌預(yù)后相關(guān)的臨床病理因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(P<0.05)，這表明VEGF家族可能參與了腫瘤的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，并有望成為一個(gè)判斷乳腺癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。對(duì)比C-erbB-2、P53與V