MHC Ⅰ-肽復合體及其多聚體簡便高效制備方法的研究.pdf

1、細胞毒性T淋巴細胞（CTL）在清除和控制病原體的感染和傳播，監(jiān)視和殺傷腫瘤細胞以及介導免疫排斥反應的發(fā)生中起著十分重要的作用。MFICⅠ-肽（pMHCⅠ）四聚體技術因其具有很高的靈敏度和特異性；受檢CTL不需體外增殖、無損傷性；能同時直接對特異性CTL進行定性、定量分析和分離純化等優(yōu)點而成為抗原特異性T細胞定量的金標準。傳統(tǒng)的pMHcⅠ四聚體制備包括以下三個過程：MHCⅠ重鏈、β2m蛋白的表達和抗原肽的合成；MHCⅠ-肽復合體的制備與純

2、化；MHCⅠ-肽復合體的生物素化和多聚體的制備。在這三個過程中存在三個技術局限，分別是：①MHCⅠ-肽復合體的制備需要合成抗原肽，步驟繁瑣；②復性過程所片j時間較長，復性產量低；⑨基于生物素和鏈酶親和素系統(tǒng)的MHCⅠ-肽四聚體法需要生物素化及多聚化過程，試劑昂貴，操作較煩瑣，需要后繼的純化與濃縮等步驟。以上技術局限限制了pMHCⅠ四聚體技術在免疫學和分子生物學等研究領域的應用。
　　 以上三個技術局限中，有六個具體的問題有待研究

3、和解決：①pMHCⅠ四聚體的技術改進之一是Uger等研究者建立的肽和β2m（β-β2m）融合表達策略制備pMHCⅠ復合體的方法，但在p-β2m重組質粒的構建中其基因第一位核苷酸受插入位點的限制；②重組蛋白能否在大腸桿菌中以可溶性的形式表達；③蛋白鑒定中Western blot實驗的儀器化操作；④pMHCⅠ復合體濃縮和純化簡便方法的研究；⑤高效簡便復性方法的開發(fā)；⑥pMHCⅠ多聚體簡便制備方法的研究。
　　 本研究選取一段腫瘤抗原

4、肽CEA694-702和一段病毒抗原肽 HBc18-27，采用肽和β2m融合表達的策略制備MHC-CEA694-702和MHC-HBc18-27復合體及其多聚體，并對以上6個方而的問題進行較全面的研究。結果如下：
　　 1.所設計的同尾酶酶切-連接策略克服了插入基因序列第一個核苷酸的限制，使構建肽和β2m融合基因更加靈活方便。在p-β2m基因中不含所涉及的酶切位點時，結合不對稱酶方法，可以將任意p-β2m基因插入到任意質粒的任意

5、酶切位點中，而沒有目的基因起始核苷酸的限制。通過常規(guī)酶切-連接方法成功構建了5種重組質粒，分別是：pET32a-Trx-HIS-HC-BSP、pET28a-HC-BMP-HIS、pET28a-HC-HIS、pET28a-CEA694-702-β2m-HIS和pET28a-CEA694-702-β2m；通過同尾酶技術構建成1種重組質粒pET28a-HBc18-27-β2m。這6種重組質粒含有序列正確的目的基因，可以在BL21（DE3）中誘

6、導出相應的蛋白。
　　 2.在宿主菌BL21（DE3）中三種MHC重鏈蛋白（Trx-HIS-HC-BSP、HC-BSP-HIS和HC-BMP-HIS）和兩種p-β2m蛋白（CEA694-702-β2m-HIS和CEA694-702-β2m）在各誘導條件下均主要以包涵體形式表達，且誘導條件的不同對胞質可溶性形式表達的目的蛋白的絕對量影響不大。以包涵體形式表達的目的蛋白的量隨著誘導時間的增加而增加。采用高壓均質法破菌提取包涵體并經初

7、步純化后，三種MHC重鏈蛋白（HC-BSP-HIS、HC-BMP-HIS和HC-HIS）的產量在25 mg/L培養(yǎng)基以上，三種p-β2m融合蛋白（CEA694-702-β2m-HIS、CEA694-702-β2m和HBc18-27-β2m）的產量在50 mg/L，培養(yǎng)基以上；六種蛋白的純度均在85％以上：經Wetern blot鑒定蛋白表達正確。
　　 3.所設計并申請專利的蛋白雜交洗脫儀具有節(jié)省時間和人力、節(jié)省抗體、可規(guī)模操作

8、、結果重復性好和雜交效率高等優(yōu)點，是一種Western blot試驗很好的工具。
　　 4.運用CEA694-702-β2m-HIS和HBc18-27-β2m蛋白分別制備出結構和構象正確的MHC-CEA694-702復合體和MHC-HBc18-27復合體，與常規(guī)的MHC HC、β2m和抗原肽三個單位的復合體制備方法相比，這種肽和β2m融合策略更簡便易行，節(jié)省成本。利用離子交換色譜同時濃縮和純化了MHC-HBc18-27復合體，方

9、法快速方便，處理效率高。
　　 5.將HC-BSP-HIS和CEA694-702-β2m-HIS同時結合在IMAC色譜上進行復性不能得到純的MHC-CEA694-702復合體。利用pull-down式復性方法，通過IMAC復性了兩種MHC-CEA694-702復合體：MFC-CEA（BSP）和MHC-CEA（BMP），其中MHC-CEA（BSP）復合體通過尺寸排阻色譜、離子交換色譜和反相高效液相色譜三種色譜方法分析結果表明復合體

10、結構正確。進一步，利用我們已申請專利的pull-down式復性方法，通過IEC復性了兩種pMHCⅠ復合體：MHC-CEA694-702復合體和MHC-HBc18-27復合體；通過尺寸排阻色譜分析，這兩種復合體結構正確，純度分別為88％和82％；通過Dot-ELISA和FACS進行構象鑒定，結果表明 MHC-CEA694-702復合體構象正確。
　　 6.實驗發(fā)現HC-BMP-HIS可以結合鏈酶親和素（SA），并初步表明帶BMP-

11、tag的蛋白分子可以在SA的作用下形成多聚體。HC-BSP-HIS蛋白在大腸桿菌中表達時被部分生物素化；在2×YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)時HC-BSP-HIS包涵體的產量較高，而在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)時HC-BSP-HIS的生物素化效率較高；當培養(yǎng)基中NaCl濃度為10 mg/mL時，HC-BSP-HIS的包涵體產量和生物素化效率最高；培養(yǎng)基中生物素的濃度對HC-BSP-HIS的包涵體產量和生物素化效率均無明顯影響；在37℃和24℃時，HC-BSP-

12、HIS的包涵體的產量均隨著誘導時間的增加而增加，其中37℃誘導24 h時包涵體產量最高，而在37℃誘導6 h時HC-BSP-HIS生物素化效率最高，為25％；多聚體形成實驗初步表明，部分生物素化的BSP-tag比BMP-tag與SA的多聚化能力要高。通過抗His-tag抗體及PE標記的抗IgG抗體可以將稀釋復性法制備的MHC-HBc18-27復合體制備成MHC-HBc18-27多聚體，并能成功地檢測到乙型肝炎病毒患者PBM中的HBc18

13、-27-特異性CTL。這種抗體型pMHC多聚體的方法簡單，制備方便，是一種具有應用潛力的多聚化方法。pull-down式IEC復性法通過抗體作用形成MHC-HBc18-27多聚體后也可以成功地檢測到乙型肝炎病毒患者PBMC中的HBc18-27-特異性CTL，其檢測結果與稀釋復性法制備的MHC-HBc18-27多聚體檢測結果一致，說明pull-down式IEC復性法復性可得到具有功能活性的MHC-HBc18-27復合體。
　　 以

14、上結果提示：利用同尾酶技術可以解決p-β2m構建中的基因序列第一個核苷酸的限制，拓寬了肽和β2m融合表達策略的應用范圍；pull-down式復性方法可以成功地制備pMHCⅠ復合體，方法簡便，復性效率高，復性、濃縮和純化過程集合在一起；抗體犁多聚體技術是一種簡單有效的多聚化方法，可以成功制備出具有功能活性的pMHCⅠ多聚體。這些研究不但簡化了肽和β2m融合表達策略下的pMHCⅠ多聚體的構建并提高其制備效率和降低了制備成本，而且為優(yōu)化常規(guī)的