MHC-肽四聚體的構(gòu)建及其技術(shù)改造研究.pdf

1、背景和目的 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL或Tc）在T細(xì)胞免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用，它通過識別靶細(xì)胞表面的MHC—肽復(fù)合物而對靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷。檢測和監(jiān)測抗原特異性CTL，是了解機(jī)體細(xì)胞免疫功能和探索疾病機(jī)理的重要方法之一，也是評價特異性免疫療法的基礎(chǔ)?？乖禺愋訡TL的體外檢測方法有多種，但MHC—肽四聚體技術(shù)是目前唯一能夠直接對其定量檢測的方法。然而，MHC—肽四聚體構(gòu)建過程復(fù)雜，價

2、格昂貴，這在一定程度上限制其大規(guī)模應(yīng)用，這就要求我們一方面要構(gòu)建針對不同抗原表位的MHC—肽四聚體，另一方面也要求我們開展MHC—肽四聚體技術(shù)改造研究，簡化MHC—肽四聚體制備過程，提高其實用性和可操作性，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的產(chǎn)品，以適合和滿足我國醫(yī)學(xué)飛速發(fā)展的需要。另外，慢性HBV感染是一個全球性的重大健康問題。HBV有多種抗原成分，而每種抗原成分包含有多個抗原表位，構(gòu)建HBV不同抗原表位的MHC—肽四聚體很有必要。 本文首

3、先使用MHC—肽四聚體構(gòu)建的基本方法構(gòu)建HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚體，一方面可以為檢測和監(jiān)測乙型肝炎患者或?qū)嶒瀯游镏蠬BcAg107—115表位特異性CTL打下基礎(chǔ)，另一方面摸索和掌握MHC—肽四聚體構(gòu)建技術(shù)，可以為構(gòu)建其它抗原表位的MHC—肽四聚體或為建立抗原特異性CTL檢測的技術(shù)平臺打下基礎(chǔ)；其次將SCT改造為HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚體，以期為MHC—肽四聚體技術(shù)改造提供新思路。 試驗方

4、法 （1） HBcAg107—115表位的MHC—肽四聚體的構(gòu)建 分別將重組A2—BSP和β2m的載體用化學(xué)法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中，對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行培養(yǎng)和用IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出包涵體蛋白；提取兩種包涵體蛋白，經(jīng)SDS—PAGE電泳分析表明兩個蛋白均被表達(dá)，大小分別為33KD和12KD；將兩種包涵體蛋白和HBcAg107—115抗原肽共同稀釋復(fù)性，以組裝成MHC—肽復(fù)合物單體；用超濾器濃縮復(fù)性產(chǎn)物；用凝膠過濾層

5、析技術(shù)純化MHC—肽復(fù)合物單體，經(jīng)SDS—PAGE電泳分析表明獲得了目的蛋白；MHC—肽復(fù)合物單體在BirA酶的作用下生物素化；用超濾管離心去除生物素化產(chǎn)物中游離的生物素；用直接ELISA法定性鑒定生物素化產(chǎn)物；用BCA法測定生物素化蛋白濃度，并將生物素化蛋白和PE標(biāo)記的鏈親和素以4：1的量混合作用，從而得到MHC—肽四聚體。 （2） HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚體活性的檢測 取免疫的轉(zhuǎn)基因鼠兩只，其中一

6、只為對照;取出脾臟，分離出脾臟細(xì)胞并調(diào)節(jié)濃度;先后用制備的MHC-肽四聚體、FICT標(biāo)記的anti-CD8+抗體和PE-Cy5標(biāo)記的anti-CD3+抗體對脾臟細(xì)胞染色，使用流式細(xì)胞術(shù)分析CD3+、CD8+和MHC-肽四聚體+的細(xì)胞群頻率。 （3） SCT改造為HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚體 將BirA酶底物序列和PreScission蛋白酶切位點序列分別設(shè)計成引物，引物中引入BamHI和XhoI酶切位點

7、，以pcDNA3．0-SCT為模板，通過重疊PCR技術(shù)，獲得依次含PreScission蛋白酶切位點、SCT和BirA酶底物的基因序列;獲得的基因序列用BamHI和XhoI酶后，與同樣酶切過的載體pET32c（+）連接;連接產(chǎn)物用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109中;先進(jìn)行抗性篩選，對獲得的克隆再進(jìn)行菌落PCR鑒定和酶切鑒定，獲得重組載體;用化學(xué)法將重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中;對轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行培養(yǎng)和用IPTG誘導(dǎo)，分離菌體進(jìn)行

8、SDS-PAGE電泳分析，表明蛋白以包涵體存在，大小與預(yù)期一致;提取包涵體，進(jìn)行稀釋復(fù)性;用超濾器濃縮復(fù)性產(chǎn)物;復(fù)性產(chǎn)物換用PreScission蛋白酶緩沖液，加入PreScission蛋白酶以切除融合表達(dá)的標(biāo)簽;酶切產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明大部分蛋白被切開;酶切產(chǎn)物先后經(jīng)Ni離子親和層析和GST親和層析純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明獲得了純的目的蛋白;對目的蛋白再進(jìn)行和MHC-肽四聚體構(gòu)建的基本方法一樣的生物素化等過程

9、，最后得到MHC-肽四聚體。 （4）對比分析構(gòu)建MHC-肽四聚體的兩種方法，得出基于SCT構(gòu)建MHC-肽四聚體的優(yōu)越性。 結(jié)果和結(jié)論 （1）構(gòu)建了有活性的HBcAg107-115表位的MHC-肽四聚體，可以將其用于檢測和監(jiān)測乙型肝炎患者或?qū)嶒瀯游镏蠬BcAg107-115表位特異性CTL。 （2）構(gòu)建了重組載體pSB1，為今后進(jìn)一步研究SCT-BSP可溶性表達(dá)打下了基礎(chǔ)。 （3）將SCT-BSP構(gòu)