化學(xué)物致小鼠腭裂分子機(jī)制的研究.pdf

1、唇腭裂是口腔頜面部最常見(jiàn)的先天性畸形,在中國(guó),唇腭裂位居先天性畸形類(lèi)型的第二位.先天性唇腭裂不僅影響患兒的容貌,而且可造成患者進(jìn)食、語(yǔ)音和聽(tīng)覺(jué)障礙,影響患兒的智力發(fā)育甚至危及生命,對(duì)家庭和社會(huì)造成了沉重的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān).所以,研究先天性腭裂發(fā)生的原因和形成機(jī)制,可為及早對(duì)其進(jìn)行有效的防治提供科學(xué)的依據(jù).引起先天性腭裂發(fā)生的原因包括遺傳因素和環(huán)境因素,約20％腭裂歸因于遺傳因素,剩余的80％以上原因未知.腭的發(fā)生是包括舌的下降、雙側(cè)腭

2、板的上抬、粘連、融合等一系列復(fù)雜事件成功整合的結(jié)果.腭突發(fā)育的任一階段受到干擾如腭突生長(zhǎng)缺陷,腭突上抬的延遲或失敗,腭突融合、腭中嵴上皮細(xì)胞死亡、間充質(zhì)固化和分化等過(guò)程的失敗,均會(huì)導(dǎo)致腭裂的發(fā)生.目前研究中存在的主要問(wèn)題,一是動(dòng)物模型的選擇.鑒于大多數(shù)動(dòng)物自發(fā)性腭裂罕見(jiàn),又由于遺傳因素在腭裂中起重要作用.故以往的研究均選用自發(fā)率高的A系小鼠(如A/J,A/Wysn,A/He等),但是腭裂最高自發(fā)率為20％左右,這給腭裂機(jī)制研究的取材造成

3、一定的困難.二者僅對(duì)某一特定時(shí)間點(diǎn)單個(gè)基因作用的進(jìn)行了觀察.哺乳動(dòng)物腭發(fā)育過(guò)程的復(fù)雜性決定了腭裂發(fā)生不是一個(gè)或幾個(gè)基因突變或表達(dá)改變的結(jié)果;僅對(duì)單個(gè)基因或少數(shù)基因的研究無(wú)法確定起關(guān)鍵作用的基因及其基因之間的關(guān)系,因而難以闡明畸形發(fā)生的分子機(jī)制.因此,腭裂發(fā)生分子機(jī)制的研究必需建立適當(dāng)?shù)膭?dòng)物模型,從基因組水平進(jìn)行研究.該研究選用N—甲基—N'—乙基—甲基亞硝基胍(MNNG)和視黃酸(RA)兩種具有代表性的化學(xué)物,在畸形發(fā)生敏感期即腭發(fā)生期

4、給予小鼠,通過(guò)大體形態(tài)及光鏡、電鏡等技術(shù)手段確定腭裂異常發(fā)育表型,建立小鼠腭裂異常發(fā)育模型動(dòng)物;采用SSH這種基于基因組的差異表達(dá)基因分析方法,篩選、鑒定腭裂差異表達(dá)基因;通過(guò)比較正常小鼠和腭裂小鼠基因表達(dá)譜,確定腭裂發(fā)生相關(guān)基因,初步揭示化學(xué)物致腭裂發(fā)生的可能分子機(jī)制,從而為進(jìn)一步闡明腭裂發(fā)生的分子機(jī)制提供依據(jù).一、RA和MNNG致小鼠腭裂動(dòng)物模型的建立;甲基亞硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanid

5、ine,MNNG)同時(shí)具有致突變性、致癌性和致畸性,是代表性致突變性致畸物之一.二、MNNG和RA致小鼠腭裂畸形差異表達(dá)基因的篩選和鑒定;該研究應(yīng)用SHH技術(shù)對(duì)孕期16天的小鼠腭裂畸形和對(duì)照組相應(yīng)的腭突的差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選.然后通過(guò)克隆、蘭白斑篩選、點(diǎn)雜交等技術(shù)對(duì)篩選的差異基因進(jìn)行驗(yàn)證,對(duì)雜交有差異的克隆進(jìn)行測(cè)序和數(shù)據(jù)庫(kù)查詢,確定腭裂畸形相關(guān)基因.三、化學(xué)物致腭裂發(fā)生的可能分子機(jī)制;在哺乳動(dòng)物肢的發(fā)育中存在著Gpc3與Bmp4、Bmp

6、2、Wnt和Fgfs共表達(dá)現(xiàn)象,Gpc3在肢的發(fā)育中可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)Bmp4的反應(yīng).以往研究表明在腭的發(fā)生過(guò)程中存在受Msx1調(diào)控涉及到Shh和Bmps信號(hào)的基本網(wǎng)絡(luò),通過(guò)Msx1、Shh和Bmps之間的相互作用調(diào)節(jié)著間充質(zhì)細(xì)胞的增殖.該研究結(jié)果顯示RA和MNNG誘致的腭裂中有Gpc3的抑制表達(dá),而且肢和頜面的發(fā)育具有一定的相似性,故推測(cè)腭裂發(fā)生中存在這樣一種基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò):即Gpc3抑制表達(dá)可能使細(xì)胞失去對(duì)Bmp4的反應(yīng)而導(dǎo)致了MEE中Sh