NUDC與血小板生成素受體之間相互作用及其活性的研究.pdf

1、血小板減少癥是一種嚴(yán)重的疾病，過(guò)去主要是先天性遺傳病，近年來(lái)隨著放療和化療的癌癥病人的增多而逐年增加。一直以來(lái)治療血小板減少癥的方法主要是血小板輸注法。血小板生成素(Thrombopoitin，TPO)的發(fā)現(xiàn)為治療血小板減少癥提供了新的途徑。TPO是刺激巨核細(xì)胞增殖和分化的主要細(xì)胞因子，其在體內(nèi)可明顯刺激血小板生成，但不幸的是在臨床應(yīng)用時(shí)發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射TPO容易產(chǎn)生中和抗體并有其他副作用。 為了尋找能夠治療血小板減少癥的新藥，本論

2、文以血小板生成素受體的胞外區(qū)(Mpl-EC)為釣餌，篩選人體胎肝酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，從5×106個(gè)酵母轉(zhuǎn)化子中只獲得了人核遷移蛋白(hNUDC)，說(shuō)明該蛋白能夠與Mpl-EC在細(xì)胞內(nèi)特異結(jié)合。進(jìn)一步用pull-down實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞外檢測(cè)Mpl-EC與hNUDC的相互結(jié)合。首先用MBPpull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)兩種蛋白在細(xì)胞外的相互作用。將兩種融合蛋白，組氨酸融合蛋白His-hNUDC和麥芽糖融合蛋白MBP-Mpl-EC，在大腸桿菌中水

3、溶性表達(dá)。MBPpull-down實(shí)驗(yàn)表明MBP-Mpl-EC和MBP都能與His-hNUDC在麥芽糖親和層析柱上共洗脫，說(shuō)明MBP能夠與His-hNUDC非特異結(jié)合。由于MBPpull-down實(shí)驗(yàn)不能確定hNUDC與Mpl-EC的特異相互結(jié)合，因此改用GSTpull-down實(shí)驗(yàn)檢測(cè)融合蛋白GST-Mpl-EC與His-hNUDC在細(xì)胞外的相互結(jié)合，實(shí)驗(yàn)證實(shí)His-hNUDC能夠與GST-Mpl-EC在谷胱苷肽親和層析柱上共洗脫，而

4、不與陰性對(duì)照GST共洗脫，說(shuō)明兩種蛋白hNUDC與Mpl-EC在細(xì)胞外存在特異的直接的相互作用。以上實(shí)驗(yàn)在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞外證實(shí)了hNUDC與Mpl-EC兩種蛋白的特異結(jié)合，說(shuō)明hNUDC可能是Mpl的一枚新配體。 進(jìn)一步用酵母雙雜交的方法檢測(cè)蛋白參與結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。首先用缺失突變研究Mpl-EC和hNUDC相互作用的活性部位，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Mpl-EC參與結(jié)合的活性區(qū)域位于Mpl-EC的26-277氨基酸區(qū)，hNUDC參與結(jié)合的活性部位位

5、于100-238氨基酸區(qū)。進(jìn)一步構(gòu)建hNUDC活性部位的酵母雙雜交PCR隨機(jī)點(diǎn)突變庫(kù)找出蛋白參與結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)，用酵母雙雜交系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)hNUDC的E114，I202，E226的位點(diǎn)是影響hNUDC與Mpl-EC結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。 hNUDC與Mpl-EC兩種蛋白的特異結(jié)合提示NUDC可能在巨核細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中有重要作用?？紤]到不同物種之間蛋白序列差異可能造成其生物反應(yīng)活性降低，用RT-PCR的方法克隆小鼠同源基因mnudc，以Bal

6、b/c小鼠為動(dòng)物模型，檢測(cè)小鼠NUDC(mNUDC)在巨核細(xì)胞發(fā)育中的作用。將mnudc構(gòu)建到原核表達(dá)載體中，將其在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)和親和純化，獲得大量的融合蛋白His-mNUDC。體外無(wú)血清液體培養(yǎng)檢測(cè)His-mNUDC對(duì)小鼠巨核細(xì)胞增殖的作用，乙酰膽堿酯酶染色發(fā)現(xiàn)His-mNUDC作用下的小鼠巨核細(xì)胞數(shù)量增多，且巨核細(xì)胞體積增大。免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)加入His-mNUDC培養(yǎng)的小鼠巨核細(xì)胞核多倍體明顯增加(主要是8N和16N)，高

7、倍光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)產(chǎn)血小板的巨核細(xì)胞明顯增多。以上結(jié)果說(shuō)明His-mNUDC能夠刺激巨核細(xì)胞的增殖、分化和成熟。His-mNUDC和亞劑量的TPO(20ng/mL)同時(shí)作用能顯著刺激小鼠巨核細(xì)胞的增殖。0.25μg/mL的His-mNUDC與TPO同時(shí)作用下產(chǎn)生的巨核細(xì)胞數(shù)比TPO單獨(dú)作用下產(chǎn)生的巨核細(xì)胞數(shù)增加90％，該結(jié)果表明在體外His-mNUDC能夠與TPO協(xié)同作用顯著刺激小鼠巨核細(xì)胞的增殖，即mNUDC與TPO之間的相互關(guān)系

8、是協(xié)同作用而不是競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。體內(nèi)連續(xù)7天腹腔注射大腸桿菌中表達(dá)的融合蛋白His-mNUDC，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明His-mNUDC能增加正常小鼠的外周血血小板數(shù)，外周血血小板數(shù)在第10天達(dá)到最高值。通過(guò)測(cè)試不同劑量的實(shí)驗(yàn)組(2.5μg/kg/d，10μg/kg/d，20μg/kg/d，50μg/kg/d)，發(fā)現(xiàn)20μg/kg/d的His-mNUDC劑量組刺激外周血小板生成的作用最明顯，與空白對(duì)照組相比血小板數(shù)最高可增加86.2％。 綜上所