顆粒蛋白前體與血管生成素相互作用及其功能研究.pdf

1、血管生成素(angiogenin，ANG)是一個(gè)強(qiáng)有力的促血管生成因子，并可直接作用于腫瘤細(xì)胞。臨床調(diào)查表明它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但目前對(duì)血管生成素誘導(dǎo)血管生成和腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)還不全面，許多方面尚待進(jìn)一步研究。 基于蛋白質(zhì)相互作用在生命活動(dòng)中扮演的重要角色，我們推測(cè)蛋白質(zhì)的相互作用必定介導(dǎo)或調(diào)節(jié)了血管生成素促進(jìn)的腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程。為全面探索血管生成素功能活動(dòng)中的蛋白質(zhì)相互作用情況，本實(shí)驗(yàn)室

2、曾用酵母雙雜交技術(shù)從人心肌和肝cDNA文庫(kù)篩選獲得了一批與血管生成素可能有相互作用的候選蛋白質(zhì)，顆粒蛋白前體(Progranulin，PGRN)即為其中的一員。由于顆粒蛋白前體在調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、損傷修復(fù)和促進(jìn)細(xì)胞增殖以及促進(jìn)血管生成等方面均發(fā)揮重要功能，本論文對(duì)血管生成素與顆粒蛋白前體的相互作用及意義進(jìn)行了研究。 首先，我們利用研究蛋白質(zhì)相互作用的體內(nèi)外方法證實(shí)了血管生成素與顆粒蛋白前體的相互作用。在確證血管生成素可以在酵母細(xì)胞中

3、與顆粒蛋白前體相互作用的基礎(chǔ)上，我們利用體外免疫共沉淀證明它們?cè)隗w外有直接的結(jié)合。 然后，在HeLa細(xì)胞中分別表達(dá)了CFP-PGRN和YFP-ANG，激光共聚焦顯微鏡下觀察它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位情況。 結(jié)果顯示，CFP-PGRN單獨(dú)表達(dá)時(shí)主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，YFP-ANG單獨(dú)表達(dá)時(shí)均勻分布于細(xì)胞核內(nèi)，但兩種蛋白共同表達(dá)后，血管生成素的分布情況發(fā)生了變化，從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并與顆粒蛋白前體有細(xì)胞質(zhì)共定位。當(dāng)在HeLa細(xì)胞

4、中過量表達(dá)顆粒蛋白前體時(shí)，胞外血管生成素的核轉(zhuǎn)位被阻斷。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析也證實(shí)了血管生成素與顆粒蛋白前體在HeLa細(xì)胞內(nèi)的相互作用。 在確證顆粒蛋白前體與血管生成素的相互作用后，我們進(jìn)一步用酵母雙雜交法研究了顆粒蛋白前體中與血管生成素的作用位點(diǎn)。結(jié)果表明，顆粒蛋白前體的N-端grnPGF或C-端grnDE兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均可以與血管生成素相結(jié)合。這種相互作用也得到了體內(nèi)FRET實(shí)驗(yàn)和體外GSTpull-down實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5、的證實(shí)。同時(shí)，我們也用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)血管生成素內(nèi)與顆粒蛋白前體作用的結(jié)合位點(diǎn)或關(guān)鍵氨基酸進(jìn)行了探索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血管生成素內(nèi)與顆粒蛋白前體結(jié)合的最小片段為第63-110位氨基酸，沒有發(fā)現(xiàn)與顆粒蛋白前體相互作用的關(guān)鍵氨基酸。 為探索顆粒蛋白前體及其衍生物與血管生成素相互作用的生物學(xué)意義，我們利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析了它們對(duì)血管生成素促進(jìn)的ABE啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果表明，ABE序列在驗(yàn)證啟動(dòng)子活性的質(zhì)粒pGL3E中表現(xiàn)出啟動(dòng)子

6、活性；血管生成素可以促進(jìn)ABE啟動(dòng)子活性；顆粒蛋白前體的表達(dá)對(duì)ABE的啟動(dòng)子活性沒有影響；但顆粒蛋白前體與血管生成素相互作用能抑制血管生成素對(duì)ABE啟動(dòng)子的促轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，grnPGF和gmDE兩個(gè)結(jié)構(gòu)域也都能抑制血管生成素對(duì)ABE啟動(dòng)子的促轉(zhuǎn)錄活性。這些結(jié)果表明顆粒蛋白前體及其衍生物可以調(diào)節(jié)血管生成素的生物學(xué)活性。 基于以上研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1.顆粒蛋白前體是血管生成素的相互作用蛋白質(zhì)。 2.顆粒