顆粒蛋白前體與血管生成素相互作用及其功能研究.pdf

1、血管生成素(angiogenin，ANG)是一個強有力的促血管生成因子，并可直接作用于腫瘤細胞。臨床調(diào)查表明它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。但目前對血管生成素誘導(dǎo)血管生成和腫瘤發(fā)生的分子機制的認識還不全面，許多方面尚待進一步研究。 基于蛋白質(zhì)相互作用在生命活動中扮演的重要角色，我們推測蛋白質(zhì)的相互作用必定介導(dǎo)或調(diào)節(jié)了血管生成素促進的腫瘤血管生成及腫瘤細胞增殖等生物學(xué)過程。為全面探索血管生成素功能活動中的蛋白質(zhì)相互作用情況，本實驗室

2、曾用酵母雙雜交技術(shù)從人心肌和肝cDNA文庫篩選獲得了一批與血管生成素可能有相互作用的候選蛋白質(zhì)，顆粒蛋白前體(Progranulin，PGRN)即為其中的一員。由于顆粒蛋白前體在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、損傷修復(fù)和促進細胞增殖以及促進血管生成等方面均發(fā)揮重要功能，本論文對血管生成素與顆粒蛋白前體的相互作用及意義進行了研究。 首先，我們利用研究蛋白質(zhì)相互作用的體內(nèi)外方法證實了血管生成素與顆粒蛋白前體的相互作用。在確證血管生成素可以在酵母細胞中

3、與顆粒蛋白前體相互作用的基礎(chǔ)上，我們利用體外免疫共沉淀證明它們在體外有直接的結(jié)合。 然后，在HeLa細胞中分別表達了CFP-PGRN和YFP-ANG，激光共聚焦顯微鏡下觀察它們在細胞內(nèi)的定位情況。 結(jié)果顯示，CFP-PGRN單獨表達時主要存在于細胞質(zhì)中，YFP-ANG單獨表達時均勻分布于細胞核內(nèi)，但兩種蛋白共同表達后，血管生成素的分布情況發(fā)生了變化，從核內(nèi)轉(zhuǎn)移到了細胞質(zhì)內(nèi)，并與顆粒蛋白前體有細胞質(zhì)共定位。當在HeLa細胞

4、中過量表達顆粒蛋白前體時，胞外血管生成素的核轉(zhuǎn)位被阻斷。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析也證實了血管生成素與顆粒蛋白前體在HeLa細胞內(nèi)的相互作用。 在確證顆粒蛋白前體與血管生成素的相互作用后，我們進一步用酵母雙雜交法研究了顆粒蛋白前體中與血管生成素的作用位點。結(jié)果表明，顆粒蛋白前體的N-端grnPGF或C-端grnDE兩個結(jié)構(gòu)域均可以與血管生成素相結(jié)合。這種相互作用也得到了體內(nèi)FRET實驗和體外GSTpull-down實驗結(jié)果

5、的證實。同時，我們也用酵母雙雜交技術(shù)對血管生成素內(nèi)與顆粒蛋白前體作用的結(jié)合位點或關(guān)鍵氨基酸進行了探索。實驗結(jié)果顯示，血管生成素內(nèi)與顆粒蛋白前體結(jié)合的最小片段為第63-110位氨基酸，沒有發(fā)現(xiàn)與顆粒蛋白前體相互作用的關(guān)鍵氨基酸。 為探索顆粒蛋白前體及其衍生物與血管生成素相互作用的生物學(xué)意義，我們利用熒光素酶報告系統(tǒng)分析了它們對血管生成素促進的ABE啟動子活性的影響。結(jié)果表明，ABE序列在驗證啟動子活性的質(zhì)粒pGL3E中表現(xiàn)出啟動子

6、活性；血管生成素可以促進ABE啟動子活性；顆粒蛋白前體的表達對ABE的啟動子活性沒有影響；但顆粒蛋白前體與血管生成素相互作用能抑制血管生成素對ABE啟動子的促轉(zhuǎn)錄活性。同時，grnPGF和gmDE兩個結(jié)構(gòu)域也都能抑制血管生成素對ABE啟動子的促轉(zhuǎn)錄活性。這些結(jié)果表明顆粒蛋白前體及其衍生物可以調(diào)節(jié)血管生成素的生物學(xué)活性。 基于以上研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1.顆粒蛋白前體是血管生成素的相互作用蛋白質(zhì)。 2.顆粒